抗真菌活性物质产生菌的筛选及其产物分离纯化的初步研究

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本文以深部真菌感染主要的致病菌白色念珠菌为指示菌,从2427株细菌中筛选获得60株产生抗白色念珠菌活性物质的菌株。经过复筛和遗传稳定性考察,LDT917号菌株抗真菌活性最高且遗传性稳定,确定为出发菌株。该菌株为革兰阳性、杆状细菌,芽孢中生,进一步的生理生化实验表明其具有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的特征,对菌株LDT917的16S rDNA进行序列测定,结果表明其与Bacillus subtilis strain BFAS同源性最高,为100.0%。采用管碟法测定菌株LDT917的抗菌谱,结果显示其对临床耐氟康唑的白色念珠菌(fluconazole-resistant Candida albicans)、光滑念珠菌(fluconazole-resistant Candida glabrata)和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)均有较好的抑菌活性;同时对多株白色念珠菌(Candida albicans)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等致病真菌和细菌有抑制作用。通过自然选育和紫外诱变选育,获得了高产、遗传性稳定的菌株LDT917-383。通过单因素和正交设计实验,优化了菌株的摇瓶发酵条件,发酵培养基的最佳组成为:葡萄糖2.0%,牛肉膏1.0%,蛋白胨0.5%,pH自然;最佳发酵条件为:培养温度30℃,种龄12h,接种量10%,摇瓶培养基装量20ml/250ml,发酵时间24h。菌株LDT917-383产生抗真菌活性物质主要在发酵液中,稳定性良好,在酸性、中性、弱碱性和高温条件下稳定。通过pH纸层析试验初步确定该抗真菌活性物质为弱酸性水溶性化合物。经紫外扫描发现该化合物在256nm处有最大吸收峰。菌株LDT917-383发酵液经过预处理、薄层层析、大孔吸附树脂层析、离子交换层析等步骤,可获得粗结晶。
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