研究背景及目的唐氏综合征(Down’S Syndrome, DS)又称先天愚型,是一种发生于胎儿的遗传性疾病,其发病率在新生儿中约为1/600-1/800,据初步统计,我国每年出生唐氏综合征患儿约2.7万,平均每20min就有1例出生,占智能发育不全患儿的10%。DS是一种最常见的染色体遗传病,是由于第21对染色体异常导致的胎儿智力发育障碍,其主要特征为严重的先天性智力障碍、特殊面容,并多伴有严重的心脏病或多发畸形,生活不能自理。目前唐氏综合征还无法治疗,患儿的出生将给社会和家庭带来极大的经济负担和精神压力。近年来优生优育的观念被大部分人接受,完善产前检查成为需要,唐氏综合征筛查也成为了热点。如何在产前发现唐氏综合征胎儿,防止和降低唐氏患儿的出生,是当前产前筛查提高我国出生人口素质的重要任务。大约10年前于妊娠中期利用孕妇血清中甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)、人绒毛促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)、游离雌三醇(unconjugated oestriol, uE3)等标记物产前筛查胎儿Down综合征(DS)的方法已在国际上得到公认。但孕中期筛查并发现DS后需引产,而孕早期筛查并发现DS比之孕中期具有能尽早减轻病人因引产而带来的精神和肉体的痛苦等优点,故受到人们的关注,之后Wald等及Haddow等综合了9个国家21个产前诊断中心的研究结果,用7种血清标志物以不同组合作筛查进行比较,对包括Free β-hCG、PAPPA在内的7种标记物进行了综合分析,发现Free β-hCG与PAPPA的双联检测在孕早期的检出率最高,与孕中期的多联检测的检出率相当。之后随着高分辨率超声技术的发展,超声在产前筛查及产前诊断中的应用越来越广。Bianchi DW的研究发现孕早期Free β-hCG与PAPPA的二联检测血清筛查结合彩色多普勒超声(NT)可达到86.3%的检出率,是目前被认为最常用,最有效的妊娠早期联合筛查方案,也是唐氏综合征产前筛查的趋势。从目前国内外各医院产前筛查的检测方法看,大部分是标记免疫分析技术,此技术具有灵敏度高、特异性强等优点,已被广泛应用于产前筛查各血清标志物的基础和临床各个领域的应用研究。目前最常用的标记免疫分析技术是酶联免疫分析(Enzymatic immunoassay, EIA)、化学发光免疫分析(Chemilinescent immunoassay, CLIA)和时间分辨荧光免疫分析(Time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA),但EIA、CLIA、TRFIA在应用中存在着一些缺陷：EIA检测为一种定性,至多为半定量检测,EIA酶的活性容易受各种外在因素的影响而失活,导致EIA的灵敏度不高,酶的大分子标记容易影响被标记物的空间结构,使得EIA灵敏度的提高受到限制；CLIA影响因素较多,易受环境干扰,发光时间短,化学反应后样品只可检测一次,无法重复测量,并且为非开放性试剂,未国产化,试剂价格高；TRFIA是目前国内外产前筛查的主要免疫分析技术,但该技术测量方式复杂,反应时间长,需通过洗涤分离结合标记与游离标记,仪器成本及维修费用高,环境及样品中同位元素可导致本底干扰。近年来,由于新原理、新技术的不断应用,标记免疫技术得到了一定的发展。光激化学发光免疫分析(Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay, AlphaLISA)技术起源于1994年发明的单线态氧分子能量传递发光免疫分析技术(Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay、LOCI),后美国PerkinElmer公司生产相关试剂(AlphaScreen(?)),作为近年兴起的新型定量均相免疫学检测技术,采用了以聚苯乙烯胶乳为载体的纳米微球,实现了均相免疫测定,使操作快速简便,易实现自动化规模化检测,此外还具有灵敏度高、线性范围宽、稳定性好及价格低廉的特点,已广泛应用于生物医学研究和临床医学检验,代表了现在及未来分析检测技术的发展趋势。本研究采用该新型免疫分析技术,联合利用双抗体夹心法和生物素-链霉亲和素放大系统,研制(?)Free β-hCG与PAPPA定量检测试剂,评价自制试剂的各项性能指标,并与同类进口试剂盒进行比较,评价其在临床运用中的可行性。同时检测了中国南方地区孕妇不同孕周时Free β-hCG与PAPPA的血清含量,确立了不同孕周的中位数水平,为正常值参考范围的确定提供了一定的依据。方法：采用双抗体夹心法研制游离β-促绒毛膜性腺激素、妊娠相关血清蛋白光激化学发光免疫分析试剂。1.参考标准品的制备：用标准品缓冲液将Free β-hCG抗原配制成0ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、200ng/mL系列浓度,每瓶0.5mL分装冻干,4℃保存备用；用标准品缓冲液将PAPPA抗原配制成0mU/L、10mU/L、40mU/L、200mU/L、800mU/L、2000mU/L系列浓度,每瓶0.5mL分装冻干,4℃保存备用。2.受体微球与抗体连接：在带有滤膜的离心管中加入0.2mg包被抗体,9000rpm离心8min,每次用缓冲液(0.13mol/L, pH8.0PBS)洗涤,重复6次后,在抗体溶液中加入1mg受体微球、10μL25mg/mL NaBH3CN(用上述PBS缓冲液配制)、1.25μL10%Tween-20,最后用上述PBS缓冲液将体积补充到200μL,37℃振荡孵育48h。加入10μL65mg/mL CMO(用0.8M NaOH配制)封闭未结合位点,37℃振荡孵育1h后离心洗涤,得到已连接抗体的受体微球,调整受体微球浓度为5mg/mL。3.生物素与抗体连接：在带有滤膜的离心管中加入另一株标记抗体1mg,9000rpm离心8min。用缓冲液(含0.1%NaN3的0.1mol/L, pH9.5Na2CO3/NaHCO3)重复洗涤6次后,在50μl抗体溶液中加入5μl22mg/mL生物素(用DMSO配制),室温振动孵育4h。利用带有滤膜的离心管去除多余的生物素,并将其抗体浓度调整为1mg/mL。4.试剂性能指标的评价4.1标准曲线的绘制：以自制试剂中参考标准品浓度的对数为横坐标,信号值1×103计数的对数为纵坐标,由双对数数学模型Log-Log函数处理。4.2灵敏度实验：将零参考标准品当作样品测量20次,计算其均值及标准差。以其测定值的均值加上2倍标准差所得信号值,代入标准曲线方程计算所得出的浓度,即为其灵敏度。4.3回收率实验：取两个已知浓度的血清样本,用样本稀释液按照不同比例进行稀释,根据测出的实际值和理论值的比值,算出相应的回收率。4.4精密度实验：重复测定Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个血清质控品各10次,得到质控品检测值的均数、标准差及CV值。4.5特异性实验：将一定浓度的干扰物质作为样本进行检测后得到的相应浓度即为特异性。4.6干扰性实验：对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的样本进行测定,计算其回收率。4.7正常值参考范围：以自制试剂检测健康孕妇血清,统计其血清浓度在孕早期不同孕周中的分布情况,为自制试剂的正常值参考范围的建立提供一定的依据。4.8与国外试剂的比较实验：样本用自制试剂与PerkinElmer TRFIA诊断试剂盒进行平行测试后,对所得浓度值进行配对非参数秩和检验和相关性分析。结果：本研究研制了产前筛查孕早期血清中Free β-hCG与PAPPA的诊断试剂,并评价了试剂的各项性能指标：准确性及灵敏度、回收率、特异性、精密度、并与国外时间分辨Time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)诊断试剂盒进行比较,评价了其应用于临床检测的可行性。研究结果显示(1) Free β HCG-AlphaLISA检测试剂在优化条件下灵敏度为0.11ng/ml、线性范围为0.11-200ng/ml;稀释回收率为98%-108%；试剂分析内分析间变异系数为分析内的CV为1.32%-4.50%,分析间CV为4.69%-4.95%；与LH (luteinizing hormone)、FSH (follicle stimulating hormone)、HCG和TSH(thyroid stimulating hormone)无明显交叉反应,特异性较好；4168份8-20周的健康孕妇血清用自制试剂进行检测,建立了自制试剂在不同孕期的中位数水平,为正常值参考范围的确定提供了一定的依据；188份临床血样用本试剂与PerkinElmer TRFIA诊断试剂盒进行同时检测,配对非参数秩和检验结果如下：Z=-0.842,P=0.412>0.05,表明两试剂在检测Free β-HCG浓度上无统计学差异；进行相关性分析,相关系数(r)为0.989,相关方程为AlphaLISA=1.045TRFIA+1.580, P<0.001。(2) PAPPA-AlphaLISA检测试剂分析灵敏度为1.365mU／L,线性范围为1.365-10000mU/L;试剂分析内变异系数为5.61%-6.51%,分析间变异系数为2.07%-4.82%；与人甲胎蛋白、人泌乳素、人胎盘泌乳素、人绒毛膜促性腺激素等无交叉反应,且不易受血清中干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红素)的干扰,表示其特异性好；853份9-13周的正常孕妇血清用自制试剂进行检测,建立了孕妇血清在不同孕周时的中位数水平,为正常值参考范围的确定提供了一定依据;165份临床样本用自制试剂与PerkinElmer TRFIA诊断试剂盒进行平行检测,配对非参数秩和检验结果如下：Z=-0.197,P=0.844>0.05,表明两试剂在检测PAPPA浓度上无统计学差异；进行相关性分析,相关系数(r)为0.987,相关方程AlphaLISA=0.976TRFIA+46.808, P<0.001.结论：上述结果表明本研究研制的游离β-促绒毛膜性腺激素、妊娠相关血清蛋白光激化学发光免疫分析试剂各项指标(准确性、灵敏度、精密度、特异性等)均达到临床检测试剂要求,有望替代国内外同类试剂用于孕早期产前筛查的二联检测和基础医学研究。