目的越来越多的证据表明,微生物及其产物可以通过包括免疫调节在内的多种机制来保护机体免受细菌和病毒等病原体的侵害。肺炎链球菌肽链内切酶O(PepO)是一种在不同肺炎链球菌荚膜血清型菌株中普遍存在并且保守表达的毒力蛋白。课题组前期研究发现,PepO能够增强巨噬细胞的吞噬功能,并且该过程依赖于TLR2和miRNA-155,但确切的分子机制仍不清楚。在PepO处理后的巨噬细胞中我们检测到了含SH2域的肌醇磷酸酶1(SHIP1)表达的下调及补体受体3(CR3)表达的上调。本研究拟以SHIP1和CR3为切入点,深入探究PepO增强巨噬细胞吞噬功能的分子机制。方法体外用SHIP1过表达质粒或CR3干扰RNA转染小鼠腹腔来源的巨噬细胞,Western blot检测胞内SHIP1或CR3的表达水平以验证转染效率。PepO刺激转染后的巨噬细胞,采用吞噬实验(吞噬荧光、吞噬铺板)检测细胞对金黄色葡萄球菌以及肺炎链球菌的吞噬能力。小鼠腹腔来源的巨噬细胞转染SHIP1过表达质粒或SHIP1干扰RNA后,采用Q-PCR、Western blot分别检测胞内SHIP1和CR3的mRNA及蛋白表达水平。体内实验采用滴鼻的方式构建小鼠鼻腔感染模型。鼻腔滴注PepO蛋白后滴鼻感染金黄色葡萄球菌或肺炎链球菌,采用铺板计数的方式定量小鼠鼻腔灌洗液及肺组织中的细菌载量。采用Western blot检测鼻腔滴注PepO蛋白后小鼠支气管肺泡灌洗细胞中SHIP1和CR3的表达水平。小鼠鼻腔滴注SHIP1过表达质粒或CR3干扰RNA后,Western blot检测小鼠支气管肺泡灌洗细胞中SHIP1或CR3的表达水平以验证转染效率。转染后的小鼠鼻腔滴注PepO蛋白,再滴鼻感染金黄色葡萄球菌或肺炎链球菌,铺板计数小鼠鼻腔灌洗液及肺组织中的细菌载量。结果1.SHIP1过表达质粒有效上调了小鼠腹腔灌洗巨噬细胞中SHIP1的表达,且SHIP1过表达的巨噬细胞在PepO刺激后所吞噬的金黄色葡萄球菌以及肺炎链球菌的数量均显著低于对照组(p<0.05),提示SHIP1表达的下调介导了PepO诱导的巨噬细胞吞噬功能的增强。2.CR3干扰RNA有效下调了小鼠腹腔灌洗巨噬细胞中CR3的表达,且CR3干扰的巨噬细胞在PepO刺激后所吞噬的金黄色葡萄球菌以及肺炎链球菌的数量均显著低于对照组(p<0.05),提示CR3的上调介导了PepO诱导的巨噬细胞吞噬功能的增强。3.SHIP1过表达的巨噬细胞在PepO刺激后,CR3的mRNA及蛋白表达水平均显著降低(p<0.05),而SHIP1干扰的巨噬细胞在PepO刺激后,CR3的mRNA及蛋白表达水平均显著升高(p<0.05)。这提示SHIP1参与了CR3表达的调控,且在PepO刺激的巨噬细胞中,SHIP1表达的下调介导了CR3表达的上调,从而使得巨噬细胞的吞噬功能增强。4.与PBS对照组相比,PepO处理组小鼠鼻腔灌洗液和肺组织中金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的载量显著降低(p<0.05),提示PepO能够促进小鼠对上述细菌的清除。且PepO处理后的小鼠支气管肺泡灌洗细胞中SHIP1的表达下降而CR3的表达增加。5.鼻腔内滴注SHIP1过表达质粒可显著上调小鼠支气管肺泡灌洗细胞中SHIP1的表达。且转染SHIP1过表达质粒的小鼠在PepO处理后,其鼻腔灌洗液和肺组织中金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的载量显著增加(p<0.05),提示PepO促进小鼠对金黄色葡萄球菌以及肺炎链球菌的清除依赖于SHIP1表达的下调。6.鼻腔内滴注CR3干扰RNA可显著下调小鼠支气管肺泡灌洗细胞中CR3的表达。且转染CR3干扰RNA的小鼠在PepO处理后,其鼻腔灌洗液和肺组织中金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的载量显著增加(p<0.05),提示PepO促进小鼠对细菌的清除依赖于CR3表达的上调。结论上述结果证实,PepO增强巨噬细胞的吞噬功能是通过下调SHIP1从而上调CR3来实现的。本研究为呼吸道感染性疾病提供了一种新的预防和治疗措施,并为开发以PepO为靶点的免疫调节剂提供了有价值的理论依据。