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基底细胞样型乳腺癌(Basal-like breast cancers,BLBCs)由于缺乏激素受体,在临床治疗上缺乏靶点,对化疗药物敏感性差且易复发。表柔比星是治疗基底细胞样型乳腺癌最有效的药物之一,但是表柔比星的耐药常常影响化疗效果。常山酮来自于中药常山,可抑制包括乳腺癌在内的多种肿瘤的发生和发展。常山酮联合其它化疗药物,可增强化疗药物的治疗效果。常山酮可通过下调TGFβ信号通路增加肿瘤的放化疗敏感性。有关常山酮对基底细胞样型乳腺癌表柔比星化疗抵抗的作用研究尚未见报道。目的:本研究以耐受表柔比星的基底细胞样型乳腺癌细胞株为研究对象,阐明P-gp-自噬-NF-κB凋亡通路以及TGFβ-EMT信号通路在表柔比星耐药中的作用;探讨常山酮对基底细胞样型乳腺癌表柔比星敏感性的影响;通过研究常山酮对参与表柔比星耐药的P-gp-自噬-NF-κB凋亡通路以及TGFβ-EMT信号通路的作用,揭示常山酮调节基底细胞样型乳腺癌表柔比星敏感性的机制。方法:1.从亲本MDA-MB-231(MDA)和BT-20(BT20)细胞,筛选了两株表柔比星耐药细胞,命名为耐药细胞EPI-R和EPI-B。分别从细胞的生长、形态和在化疗药中存活率来检测其耐药性。2.用蛋白质免疫印迹法、流式细胞术、QPCR、免疫荧光实验检测P-糖蛋白(P-gp)的表达和功能,自噬的表达水平,以及自噬与NF-κB凋亡信号通路的关联,使用sh-MDR1、sh-BECN1探讨自噬与P-gp的关联,使用MTT法检测自噬和P-gp对耐药细胞在含表柔比星培养液中存活率的影响。蛋白质免疫印迹法、QPCR检测TGFβ、EMT分子标志的水平,通过划痕实验、CD24/CD29染色、肿瘤干细胞球形成实验研究耐药细胞迁移能力和干细胞等表型变化。3.使用MTT法、Brdu染色、小鼠肝肾生化指标及肝肾组织形态检测常山酮对细胞存活、增殖及对小鼠的肝肾毒性的影响;MTT法、平板克隆实验及对小鼠移植瘤肿瘤体积的观察,检测常山酮对耐药细胞表柔比星敏感性的作用。4.研究常山酮对参与表柔比星耐药的P-gp-自噬-NF-κB凋亡通路以及TGFβ-EMT信号通路的作用,探讨其影响基底细胞样型乳腺癌表柔比星敏感性的作用机制;使用蛋白质免疫印迹法、QPCR、免疫荧光、流式细胞术检测常山酮对GATA3表达的影响;通过免疫组化法、染色质免疫共沉淀技术分析GATA3和TGFβRⅡ的关联性;使用sh-GATA3后,检测常山酮调控TGFβ、EMT分子标志的表达变化,MTT法观察耐药细胞在含表柔比星培养液中的存活率,进一步探讨常山酮调节TGFβ-EMT信号通路的机制。结果:1.筛选及鉴定耐药细胞株:耐药细胞在含有8μg/ml表柔比星的培养液中稳定生长,与亲本细胞相比,耐药细胞在含表柔比星、紫杉醇、依托泊苷及顺铂的培养液中存活力均增加(p<0.05)。2.基底细胞样型乳腺癌细胞表柔比星耐药的机制:与亲本细胞相比,耐药细胞中具有高水平的P-gp和自噬;使用sh-MDR1抑制P-gp可下调自噬蛋白Beclin1的表达,增加耐药细胞对表柔比星的敏感性;使用sh-BECN1或氯喹(CQ)抑制自噬激活NF-κB凋亡通路,提高耐药细胞对表柔比星的敏感性(p<0.05)。与亲本细胞相比,耐药细胞上皮标志E-cadherin缺失,TGFβ及间质标记Vimentin表达增加,细胞迁移能力增强,上皮样干细胞富集数降低,间质样干细胞富集(也是肿瘤干细胞富集)数增加,肿瘤干细胞球形成能力增加(p<0.05)。3.常山酮对基底细胞样型乳腺癌表柔比星耐药的增敏作用:体外实验200n M、体内实验0.1 mg/kg的常山酮毒性小;与DMSO处理组相比,常山酮联合表柔比星可明显抑制耐药细胞的存活、增殖及小鼠移植瘤的肿瘤生长(p<0.05)。4.常山酮对基底细胞样型乳腺癌表柔比星耐药的增敏机制:与DMSO处理组相比,常山酮下调P-gp、抑制自噬、激活NF-κB凋亡信号通路(p<0.05)。与DMSO处理组相比,常山酮和表柔比星协同增加耐药细胞的E-cadherin表达,抑制Vimentin表达,降低TGFβ、EMT分子标志的表达,减弱迁移能力及干细胞等EMT表型(p<0.05)。与DMSO处理组相比,常山酮和表柔比星协同增加GATA3蛋白和m RNA水平,常山酮处理后增加了GATA3与TGFβRⅡ启动子结合,抑制TGFβRⅡ转录;在常山酮组使用sh-GATA3,与使用scramble相比,提高TGFβ、EMT分子标志的表达,增加耐药细胞在含表柔比星培养液中的存活率(p<0.05)。结论:1.本研究成功建立了基底细胞样型乳腺癌表柔比星耐药细胞。2.P-gp-自噬-NF-κB凋亡信号通路以及TGFβ-EMT信号通路参与调控基底细胞样型乳腺癌表柔比星耐药。3.常山酮显著增加耐药细胞对表柔比星的敏感性。4.常山酮主要通过增加GATA3抑制TGFβ-EMT信号通路,增加基底细胞样型乳腺癌对表柔比星的敏感性。