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目的通过将miR-26a模拟物分别转染不同p53及Rb1基因背景的人肝癌细胞系(p53野生型Hep G2细胞、p53突变型PLC/PRF/5细胞及不表达p53和Rb1基因的Hep3B细胞),观察miR-26a表达上调对三种不同人肝癌细胞凋亡水平的影响,并进一步探讨miR-26a转染诱导人肝癌细胞凋亡的可能机制。方法1.将15例人原发性肝癌手术切除标本中的肝癌组织及癌旁组织分别应用石蜡包埋组织micro RNA快速提取试剂盒提取miRNA分子,并利用q RT-PCR(Real Time Quantitative,实时荧光定量PCR技术)对目标miRNA分子的表达水平进行检测。2.将三种不同p53及Rb1基因背景的人肝癌细胞系分别接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中进行培养,直至对数生长期。3.将miR-26a模拟物(mimic)及模拟物的阴性对照(mimic negative control)分别转染不同p53及Rb1基因背景的三种人肝癌细胞系,并应用Annexin V-FITC/PI双染法检测miR-26a模拟物转染后三种不同人肝癌细胞凋亡水平的变化。4.以细胞骨架蛋白β-actin的表达水平为内参,应用Western blot技术检测miR-26a模拟物转染后三种人肝癌细胞p53蛋白、p-p53(phospho-p53,磷酸化的p53蛋白)、PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis,p53上调凋亡调控因子)蛋白表达水平的变化。5.再次应用Western blot技术检测miR-26a特异性模拟物转染后Hep G2细胞及PLC/PRF/5细胞中Rb1蛋白表达水平的变化,并根据生物信息学预测结果,构建含有miR-26a结合位点Rb1 3′UTR片段的荧光素酶报告基因载体(p MIR-Rb1-3’UTR)及其突变型报告基因载体(p MIR-mut-Rb1-3’UTR)进行双荧光素酶报告基因实验。6.应用免疫共沉淀法检测miR-26a转染后p53野生型Hep G2细胞内与E2F1结合Rb1蛋白水平的变化,并应用Western blot检测游离E2F1蛋白的水平。7.统计学分析:应用SPSS 17.0统计学软件对实验结果进行分析,P<0.05认为差异具有显著性。结果1.在15例人原发性肝癌手术切除标本中,肝癌组织miR-26a的表达水平较癌旁组织显著降低。2.通过瞬时转染miR-26a模拟物,三种人肝癌细胞miR-26a的表达水平均显著上调,而转染miR-26a模拟物的阴性对照,对肝癌细胞miR-26a的表达无明显影响。3.三种人肝癌细胞中,仅p53野生型Hep G2细胞在转染miR-26a模拟物后其凋亡水平显著增加,p53突变型的PLC/PRF/5细胞及不表达p53和Rb1基因的Hep3B细胞转染miR-26a模拟物后,其凋亡水平均未发生明显变化。4.p53野生型Hep G2细胞转染miR-26a后,p53蛋白的表达水平及其磷酸化水平(p-p53)均明显增加,且p53野生型Hep G2细胞的凋亡调控相关转录靶基因PUMA的表达水平也明显上调。而p53突变型的PLC/PRF/5细胞转染miR-26a模拟物后,p53蛋白表达水平上调,但p-p53及PUMA蛋白表达水平均未见显著变化;不表达p53和Rb1基因的Hep3B细胞转染miR-26a模拟物后,p53、p-p53及PUMA蛋白表达水平均未发生显著变化。5.miR-26a通过与Rb1 3’UTR靶位点的特异结合抑制Rb1的表达。p53野生型Hep G2细胞和p53突变型PLC/PRF/5细胞转染miR-26a模拟物使其miR-26a表达水平上调后,其Rb1蛋白的表达水平均明显降低。6.转染miR-26a模拟物后,p53野生型Hep G2细胞内与E2F1结合Rb1蛋白水平显著降低,而E2F1蛋白水平则显著增加。结论作为抑癌基因,miR-26a在人肝癌细胞中的表达水平显著下调,上调miR-26a的表达水平,可使p53野生型Hep G2细胞的凋亡水平显著增加。进一步研究发现,在肝癌细胞中,miR-26a可以直接调控Rb1的表达,miR-26a转染可通过p53依赖的Rb1/E2F1信号途径诱导细胞凋亡。