活性氧(ROS)是正常的细胞代谢产物,低浓度或适中浓度的ROS可以参与调控细胞对传染性病原体等有害物质的细胞应答、调控一系列细胞通路以及诱导促有丝分裂反应应答等有益作用。但是当细胞受到有害异物、药物、重金属和电离辐射等外界因素刺激时,细胞内ROS大量积累,导致促氧化反应/抗氧化反应之间的平衡受到破坏,产生氧化应激。过量的ROS会破坏细胞内正常脂质、蛋白质和DNA功能的发挥,进而引起多种人类疾病,包括糖尿病、心血管疾病和癌症等。为了耐受氧化应激,细胞逐渐演变出各种适应机制,最重要的当属Keap1-Nrf2-ARE信号通路。正常情况下,Keap1蛋白介导的E3泛素连接酶对细胞内的Nrf2进行多聚泛素化修饰,进而被蛋白酶体降解,使Nrf2蛋白维持在一个很低的水平。当细胞受到氧化应激时,Keap1蛋白的构象发生改变,与Nrf2的结合减弱,削弱了靶向Nrf2的泛素化修饰和降解,从而使更多新合成的Nrf2能够转移入核,结合到相应靶基因启动子的ARE序列上,激活下游抗氧化损伤基因的转录,减弱氧化应激对细胞的损伤。除了Keap1-Nrf2-ARE信号通路以外,Nrf2蛋白作为抗氧化应答中最核心的转录因子,还能参与非Keap1依赖的抗氧化损伤途径。随着对Nrf2在抗氧化损伤中作用研究的进一步深入,Nrf2蛋白本身的翻译后修饰也逐渐引起科学家们的关注。目前发现Nrf2能发生磷酸化修饰、乙酰化修饰、泛素化修饰和精氨酸甲基化修饰等,不同位点的不同修饰能影响Nrf2的核质分布,影响对下游靶基因的转录调控等。但是目前并没有对Nrf2蛋白糖基化修饰的报道和研究。我们的研究发现,在氧化剂叔丁基对苯二酚tBHQ处理人肝癌细胞系HepG2后,细胞内Nrf2的蛋白量升高,但是其糖基化修饰水平降低,表明Nrf2蛋白的糖基化修饰可能在抗氧化损伤应答中发挥作用。HepG2细胞中内源IP实验显示,细胞内确实存在着Nrf2蛋白的糖基化修饰。O-linkedβ-N-乙酰葡萄糖氨转移酶(OGT)是哺乳动物中唯一能介导蛋白发生糖基化修饰的酶。通过大肠杆菌中的共转化实验,我们发现Nrf2也能被OGT糖基化。为了找到Nrf2蛋白具体的糖基化位点,我们在共转化his-OGT和GST-Nrf2质粒的大肠杆菌中纯化出的Nrf2蛋白进行了质谱分析,在捕捉到的有效肽段中,第80位苏氨酸和第221位苏氨酸被糖基化修饰。为进一步明确Nrf2蛋白糖基化修饰的主要位点,我们构建了单点突变质粒和双点突变质粒。在大肠杆菌中分别将上述质粒与his-OGT共转化后,发现80位苏氨酸是主要的发生糖基化修饰的位点。同时,我们发现细胞内源干涉OGT表达后,细胞内Nrf2蛋白的表达水平升高,但其mRNA水平基本没有改变,说明糖基化修饰可能会影响Nrf2蛋白的稳定性。通过对野生型Nrf2和80位苏氨酸点突变Nrf2的对比实验,我们发现突变后的Nrf2基本丧失了与Keap1的结合能力,从而更多的转移入细胞核内,调控下游靶基因转录。综上,我们发现了Nrf2蛋白的一种新的翻译后修饰——糖基化修饰,并证实Nrf2的第80位苏氨酸是主要的发生糖基化修饰的位点,发生糖基化修饰的Nrf2更加不稳定,更易被蛋白酶体降解。这一新的发现预示着可以开发新的OGT抑制剂,稳定Nrf2蛋白转移入核,从而在抗氧化应激中发挥重要作用,为保护细胞免受氧化损伤提供了新的治疗靶点和思路。