抗体是一类重要的生物技术药物,具有广阔的应用前景。目前,蛋白A亲和层析是抗体分离的平台技术,具有高度特异性,但是存在成本高、洗脱条件苛刻、蛋白配基易脱落等问题。寻求经济高效的抗体分离新方法,具有重要的意义。混合模式层析和短肽仿生层析是目前抗体分离的新技术,目前对其的认识还不够深入。本论文以抗体的高效分离为目标,以混合模式层析介质分离抗体为起步,比较和评价混合模式配基在分离抗体时的作用和效果,然后分子对接比较混合模式配基和短肽配基,得出短肽配基对抗体具有更好的选择性。利用分子模拟分析短肽配基-抗体相互作用,以此作为设计四肽配基库的重要依据,筛选出相应的四肽配基,用于制备以新型四肽为配基的仿生层析介质,以提高抗体的分离性能。首先比较了四种商业化混合模式介质对抗体的分离性能,分别是Bestarose Diamond MMA、Bestarose Diamond MMC、MEP HyperCel和PPA HyperCel。以人免疫球蛋白(hIgG)和牛血清白蛋白(BSA)混合料液为分离对象,采用上述四种介质进行了分离纯化的比较。pH梯度洗脱结果表明,Bestarose Diamond MMA抗体分离效果最好,经进一步优化pH阶跃洗脱,发现在用pH5.0进行洗脱时,hIgG纯度和收率分别达到了97.9%和92.8%。即使上样量从1 mL升至10mL, hIgG仍能维持满意的纯度和收率。另一方面,通过调控盐浓度也可实现抗体的有效分离,当平衡缓冲液中添加0.5 M氯化钠时,hIgG纯度和收率可分别达到95.4%和90.1%。由此证明混合模式层析分离抗体的可行性,为新型小分子配基的设计提供依据。其次,利用分子对接,探讨了小分子配基与抗体相互作用,发现短肽配基比混合模式配基具有更好的抗体选择性。以短肽配基DAAG为模型,结合分子对接和分子动力学模拟,探讨了DAAG与IgG-Fc片段的相互作用机制。结果发现,DAAG配基能够与保守结合区域充分结合,实现几何匹配和能量匹配。在中性条件(pH 7.0)下,DAAG配基和Fc-A片段的结合包括多种作用力,如离子键、疏水作用、氢键、范德华力和pi-阳离子作用等,实现了配基的强亲和力和高选择性。在酸性条件下,DAAG配基与Fc-A片段之间存在排斥力,减弱了吸引力,导致配基从蛋白表面解离。基于配基-抗体间分子作用力的综合分析,提出了短肽仿生配基的设计模式,指导新型短肽仿生配基的设计。第三,基于上述分子模拟结果和文献数据,设计了四肽配基库,Ac-HN-Aro-Aro-R-Aro/Ali-COOH。利用柔性对接和分子动力学模拟,实现双重筛选,确定最佳四肽配基为Ac-YFRH。以氨基活化琼脂糖凝胶为基质,采用HATU化学合成,实现四肽配基的高效偶联,制备了新型Ac-YFRH四肽介质。静态平衡吸附表明,介质对hIgG吸附量随pH降低而降低,且具有较好的非盐依赖吸附能力。以hIgG和BSA混合溶液为模拟料液,在1M氯化钠的中性条件下吸附,pH 5.0洗脱,hIgG纯度和收率分别达到98.4%和89.4%,表明新型四肽仿生层析介质具有良好的抗体分离性能。最后,制备不同配基密度的Ac-YFRH四肽介质,考察了系列介质对hIgG的吸附和分离性能,探讨了盐浓度对静态吸附容量,吸附动力学和动态载量的影响。结果表明,随配基密度上升,hIgG静态吸附容量增大,而表观解离常数减小；孔扩散模型能较好地拟合hIgG的吸附动力学曲线,但也发现蛋白的表面结合阻力对吸附的影响较大。穿透实验表明,介质对hIgG的动态载量也随着配基密度的增加而增加。在高流速下,介质对hIgG的动态载量较低；而在中低流速下,动态载量变化较小,且达到静态吸附容量的41.2%。考察了采用101 μmol/g配基密度的四肽层析介质分离复杂料液的效果,包括牛乳清中分离牛免疫球蛋白(bIgG)和CHO细胞培养上清液中分离单克隆抗体。当层析柱保留时间为3分钟时,介质对bIgG和单抗的动态载量分别为1.6mg/mL介质和12.5mg/mL介质。经优化上样和洗脱条件,bIgG纯度和收率分别为84.3%和86.9%,单抗纯度和收率分别为95.7%和86.2%。这些结果充分显示了新型四肽层析介质在分离抗体时的良好性能。本文围绕抗体的高效分离,从混合模式层析分离入手,通过抗体选择性比较引出短肽配基,探讨配基-抗体相互作用,设计和筛选高亲和力的四肽配基,评价吸附性能,实现复杂料液中高效分离抗体。研究结果有助于深入了解混合模式层析和短肽仿生层析的抗体分离模式,为新型配基设计和分离过程优化提供指导。