阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)即老年性痴呆,是一种原发性神经退行性疾病,主要表现为进行性认知功能障碍,学习、记忆功能的丧失,晚期出现严重痴呆。目前,全球约有3560万AD患者。AD典型病理特征之一是脑内出现高密度的老年斑。研究表明,老年斑的主要成分是由39-43个氨基酸组成的淀粉样β蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)。全长Aβ片段的神经毒性作用已有广泛报道,但Aβ神经毒性作用的活性中心和作用机制仍存在很大争议。已有大量实验表明,Aβ25-35是全长Aβ分子中一个较短的活性片段。本研究室在以往的研究中发现,另外一个由5个氨基酸组成的短肽Aβ31-35也能在细胞培养、离体膜片钳和在体电生理实验中表现出与Aβ25-35类似的神经毒性作用。提示:31-35序列可能是Aβ分子中的一个更短的活性片段。然而,Aβ31-35是否在行为学上也能影响大鼠的学习记忆功能尚未见报道。AD的另一个病理特征是基底前脑胆碱能神经元大量丢失。AD患者脑内,特别是在与学习记忆密切相关的大脑皮层和海马内,已发现烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs)数量的明显减少。哺乳动物脑内的nAChRs广泛参与各种生理过程,包括学习和记忆等认知功能。最常见的nAChRs亚型有α4β2-nAChRs和α7-nAChRs,据报道,Aβ能够引起胆碱能系统功能紊乱和认知功能缺陷。我们在以往的研究中也发现α4β2-nAChRs参与了Aβ所引起的海马长时程增强(long-term potentiation, LTP)的压抑。近年来,一些研究表明α7 nAChRs在神经系统的发育、分化以及病理过程中发挥着十分重要的作用,而且,Aβ1-42与α7 nAChRs有更高的亲和力。因此,α7 nAChRs可能在AD的发病或Aβ的毒性作用中具有更加重要的病理意义。然而,有关α7 nAChRs的报道目前仍然存在着很大争议。例如,有报道显示,AD病人脑内α7 nAChR亚型蛋白以及mRNA明显升高;非选择性的nAChR激动剂nicotine增强了Aβ1-40对在体海马LTP的压抑作用。但也有报道表明,α7 nAChRs的缺失加重了AD动物模型中Aβ的沉积和早期的认知功能缺失。可见,α7 nAChRs在Aβ引起的海马LTP以及空间学习记忆功能损伤中的作用仍然需要证实。因此,本实验利用电生理和行为学实验手段,采用侧脑室给予Aβ25-35、Aβ31-35及α7 nAChRs特异性的激动剂choline和拮抗剂MLA的方法,观察了Aβ31-35对大鼠海马突触可塑性和空间学习记忆行为学的影响,探讨了Aβ所致神经毒性中的α7 nAChRs机制,旨在为AD的发病机制以及AD的防治提供可能的新思路。实验具体分为以下两部分:目的:本实验通过急性侧脑室内注射Aβ25-35、Aβ31-35以及α7 nAChRs特异性的激动剂choline和拮抗剂MLA,记录海马场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potentials, fEPSPs),研究了不同的Aβ片段对大鼠海马CA1区在体LTP的作用以及可能的α7 nAChRs机制。方法:实验采用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,麻醉后将其固定于脑立体定位仪上,分别将脑室套管和绑定在一起的同心圆双电极刺激电极和单极记录电极,精确插入到侧脑室或海马的刺激与记录部位。通过给予海马Schaffer侧枝单个电刺激、强直电刺激和双脉冲刺激,在海马CA1区放射层诱发和记录基础的fEPSPs、强直刺激引起的fEPSP的长时程增强即LTP,以及配对脉冲引起的双脉冲易化(paired pulse facilitation, PPF)。经脑室套管向侧脑室内注射Aβ25-35、Aβ31-35、choline、MLA观察各种药物对基础fEPSPs、LTP以及PPF的影响。结果:(1)Aβ25-35和Aβ31-35均不影响基础性突触传递,但对于高频刺激引起的LTP具有明显的压抑作用。给予HFS后15 min、30 min、60 min,对照组fEPSPs幅度增强至161.0±4.1%, 154.2±4.0%和145.3±2.6%;25 nmol Aβ25-35预处理30min并给与HFS后,fEPSPs幅度分别只有131.5±3.0%, 129.6±3.7%和123.7±2.8%;同样,给予25 nmol Aβ31-35后其幅度只有138.7±5.6%, 137.9±3.7%和129.0±3.8%。表明:两种Aβ片段均可明显压抑海马CA1区的LTP (P<0.01)。(2)单独给予α7 nAChRs特异性的激动剂choline后,基础性突触传递和LTP都没有发生明显改变,但却显著加强了Aβ31-35对在体LTP的压抑作用。Choline与Aβ31-35共同给药组LTP值在HFS后15 min, 30 min和60 min时分别为123.3±4.0%, 117.4±4.9%和112.8±3.7%,与单独给予Aβ31-35组比较,LTP值明显降低(P<0.05)。表明choline能够加强Aβ的LTP伤害作用。(3)单独给予α7 nAChRs特异性拮抗剂MLA后,海马LTP被显著抑制,但与Aβ31-35合用时却部分保护了Aβ31-35对在体LTP的损伤作用。在单独MLA处理组(10ug),HFS后15 min、30 min和60 min时LTP值分别降至139.8±4.2%, 134.5±2.8%和125.8±1.9%(P<0.01);在MLA与Aβ31-35合用组,LTP值分别为154.2±7.6%, 152.1±5.8%和143.8±2.7%,较单独给予Aβ31-35组明显增高(P<0.01或P<0.05)。说明MLA能够部分逆转Aβ对LTP的伤害效应。(4)实验中各组PPF都没有显著差异,提示所用各种药物影响LTP主要不是通过突触前机制实现的。结论:脑室内注射Aβ25-35和Aβ31-35能够同等程度地压抑大鼠海马在体LTP,α7 nAChRs的特异性激动剂choline能够增强Aβ31-35的压抑作用,而α7 nAChRs的特异性拮抗剂MLA却能保护Aβ31-35对在体LTP的损伤作用。结果提示,脑内Aβ分子的31-35序列和α7 nAChRs可能都是AD治疗的潜在靶点,α7 nAChRs可能参与了Aβ引起的在体大鼠海马CA1区LTP的伤害作用。因此,我们推测,在AD的治疗过程中,适当下调α7 nAChRs的活动可能有助于认知功能的改善。目的:本实验利用Morris水迷宫测定大鼠空间学习记忆功能,观察了侧脑室给予Aβ25-35、Aβ31-35、choline、MLA、以及合用choline或MLA和Aβ31-35后,大鼠在Morris水迷宫中的行为学表现,探讨了α7 nAChRs在Aβ引起的空间学习记忆功能损伤中的作用。方法:实验取运动灵活、无视力障碍的成年雄性SD大鼠(230-250g)随机分组,行Morris水迷宫定位航行和空间探索实验,分别测定大鼠的空间学习和记忆能力。主要指标包括大鼠寻找水下平台的平均逃避潜伏期和游过距离、撤离平台后大鼠在目标象限游过时间(限定时间为:120秒)和距离。同时,测定各组大鼠的游泳速度以及大鼠的视力以排除运动能力与视力障碍对测定指标的影响。各种药物均由侧脑室给予。结果:(1)对照组大鼠学习记忆功能正常。逃避潜伏期在训练第1、2、3、4、5天分别为113.7±3.6 s, 44.6±3.7 s, 29.2±2.3 s, 23.1±1.3 s和18.2±0.7 s;大鼠找到平台所游过的距离分别为2461.4±130.1 cm, 738.1±59.4 cm, 475.9±50.6 cm, 362.9±22.5 cm和270.2±14.0 cm;撤除平台后大鼠在目标象限所花的时间和距离分别为49.6±1.9 s和1090.5±83.4 cm。(2)侧脑室注射25nmol Aβ31-35与Aβ25-35后显著降低了大鼠的空间学习和记忆能力,与对照组相比,平均潜伏期和游过距离两个指标在第2-5天都明显延长,分别为35.9±1.2 s和654.2±32.8 cm(P<0.01或P<0.05);撤除平台后大鼠在目标象限游泳所占时间和距离显著缩短,分别为37.9±1.8 s和655.9±25.5 cm(P<0.01)。(3)侧脑室注射α7 nAChRs激动剂choline(100 ug)后,大鼠的学习、记忆功能均未受到影响,但联合给予choline与Aβ31-35后,与Aβ31-35相比,平均潜伏期和游过距离两个指标在第3-5天都明显延长,分别为68.2±5.9 s, 53.0±7.2 s, 39.0±2.7 s和1394.2±184.8 cm, 872.4±115.9 cm, and 595.9±39.2 cm(P<0.01),撤除平台后大鼠在目标象限游泳所用时间和距离显著缩短,分别为33.2±1.3 s和588.3±26.9 cm(P<0.05)。(4)侧脑室注射α7 nAChRs特异性的拮抗剂MLA(10 ug)后,大鼠的定位航行和空间探索能力均明显降低(P<0.01或P<0.05)。但联合给予MLA与Aβ31-35后,MLA部分逆转了Aβ31-35所引起的学习记忆功能损伤。大鼠在定位航行实验中第2-5天的平均潜伏期分别为61.5±3.8 s, 32.8±2.2 s, 25.0±2.8 s和19.6±0.6 s,游过距离为1031.8±107.9 cm, 450.0±51.0 cm, 362.6±33.8 cm和253.2±17.5 cm;空间探索实验中大鼠在目标象限游泳所用的时间和距离分别为52.8±1.6 s和926.4±42.8 cm。与单独给予Aβ31-35相比,大鼠的学习、记忆功能均有显著改善(P<0.01或P<0.05)。(5)各实验组动物在可视化平台实验中的逃避潜伏期和游泳速度均没有显著区别。结论:侧脑室注射Aβ31-35或Aβ25-35能够同等程度地伤害大鼠的空间学习和记忆能力,该结果为我们提出的“31-35序列可能是Aβ分子的最短活性中心”假说提供了直接的行为学证据。同时,α7 nAChRs激动剂实验表明, choline预处理可加强Aβ对大鼠的空间学习记忆功能的损伤作用;α7 nAChRs拮抗剂实验表明,脑室内单独给予MLA(10 ug)可降低大鼠的空间学习、记忆能力,但MLA的预处理能够有效对抗Aβ31-35引起的大鼠空间学习记忆损伤。这一结果提示,α7 nAChRs可能参与了Aβ引起的空间学习记忆功能的伤害过程,适当下调α7 nAChRs功能活动可能有助于AD的治疗。