【背景】流感病毒的广泛传播给世界各地带来了沉重的经济负担和社会负担,接种流感疫苗是预防流感的有效方法。犬肾细胞（Madin Darby canine kidney,MDCK）为贴壁型细胞,分离于正常成年可卡犬的肾脏组织,该细胞对流感病毒较为敏感,在研发与生产细胞基质流感病毒疫苗方面具有很高的应用价值。基于MDCK细胞基质生产流感疫苗时,通常在疫苗成品中会残留宿主细胞蛋白（host cell protein,HCP）,疫苗中残留HCP引起机体的不良反应严重影响了疫苗产品的安全性和有效性。为保证产品质量,有必要对HCP水平进行有效控制。因此,需要灵敏、稳定的检测方法检测疫苗中残留的HCP。【目的】建立一种能够检测MDCK细胞基质流感疫苗中HCP的双抗体夹心ELISA方法并进行验证。【方法】通过培养MDCK细胞获取工艺特异性的MDCK HCP,进一步处理获得参考品。将MDCK HCP分别免疫新西兰兔和波尔山羊获得抗HCP的多克隆抗体。抗体经纯化后进行SDS-PAGE分析,间接ELISA分析鉴定抗体效价并验证特异性,选择效价较高的兔抗体作为包被抗体,使用HRP标记羊抗体获得显示抗体,从而建立检测MDCK HCP的双抗体夹心ELISA方法。确定该方法所用抗体的工作浓度以及线性范围,验证准确性,重复性,中间精密度,耐用性和特异性。然后,使用该方法对生产过程中的样品进行检定,检测结果与商品试剂盒的结果进行比对。【结果】通过两步层析制备的参考品为多种蛋白的混合物,大小分布在25-80k Da之间,总蛋白浓度为31.74μg/m L。免疫新西兰兔和波尔山羊获得高质量抗体,抗体效价分别为1:512000,1:128000,纯化后的多抗特异性良好。选择抗体效价较高的兔抗体作为包被抗体,工作浓度较高的酶标羊抗作为显示抗体建立了ELISA方法。方阵滴定法确定了包被抗体工作浓度为4μg/m L,显示抗体的工作浓度为1:3200,该方法在20～400 ng/m L的范围内线性关系R2>0.99,不同浓度的MDCK HCP回收率在95.62%～113.82%之间,变异系数<10%,重复性和中间精密度结果的变异系数<10%。使用该方法对生产样品进行检测,统计学结果无差异。【结论】建立了能够检测MDCK细胞基质流感疫苗中残留HCP的双抗体夹心ELISA方法,该方法的方法学验证结果良好,可用于MDCK细胞基质流感疫苗生产中对残留HCP的检定,对疫苗生产的质量控制具有重要意义。