背景:心肌缺血再灌注损伤(myocardium ischemic reperfusion injury,MIRI)是指短时间内心肌组织缺血出现组织损伤,而当恢复血供时心肌缺血性损伤更为严重的现象。常见于心脏手术、冠脉搭桥、脏器血供梗塞后再通等情况,这种损伤阻碍心肌从再灌注中获得修复,成为临床上的一个主要难题[1]。心肌缺血再灌注损伤常常伴随出现机体氧化应激、炎症反应和组织损伤,其机制包括活性氧族爆发、钙超载、心肌能量代谢障碍、中性粒细胞激活、炎性因子释放和细胞凋亡等,MIRI的过程也就是炎症反应不断加剧、持续恶化的过程[2-5]。许多学者做了关于MIRI保护方面的研究。有研究发现胆碱能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway,CAP)可能是MIRI的保护机制之一[6]。CAP一条异于传统体液抗炎的免疫调节通路,它通过迷走神经和乙酰胆碱进行免疫调控,进而起到抗炎作用。与传统体液抗炎机制相比,CAP通过内源性的神经反馈调节来达到调控炎症反应、减轻炎症损害的作用,具有更快速、更易控的特点,因而在调控MIRI的炎症反应中更具优势[7-9]。右美托咪定是一种新型高选择性α2-肾上腺素能受体激动剂,在重症监护病房及临床麻醉中被广泛应用[10]。研究发现,右美托咪定对肺、肾等器官损伤具有保护作用,可减少细胞凋亡、抑制炎症反应[11-13]。近年来,多项研究表明,右美托咪定对心脏损伤也有一定的保护作用,包括减轻心肌缺血再灌注损伤、稳定心律等,而且可降低心脏手术并发症的发生。[14-16]。右美托咪定有兴奋迷走神经,减慢心率的作用,同时又有抗炎作用,这些药理特性,与CAP作用于神经中枢,兴奋迷走神经,起到抑制炎症反应的特点极为相似。另外,右美托咪定作为一种中枢镇静镇痛药,作用靶点也是中枢神经系统。因此,本课题以大鼠缺血再灌注心肌为模型,并结合临床样本资料进行研究分析,探讨CAP对缺血再灌注损伤心肌的作用及右美托咪定的干预作用。目的:通过构建大鼠心肌缺血再灌注模型及研究分析临床样本资料,探讨CAP对心肌缺血再灌注损伤的作用机制。为阐明右美托咪定在缺血再灌注损伤心肌中的作用及其临床应用提供理论依据。方法:第一部分右美托咪定对心肌缺血再灌注的保护作用1、大鼠心肌缺血再灌注模型:取健康大鼠60只随机分为四组,每组15只。第一组为假性手术组;第二组为心肌缺血再灌注模型(对照组),缺血前静脉注射生理盐水预处理10min;第三组为心肌缺血再灌注模型(dex组),缺血前静脉注射右美托咪定预处理10min。第四组为心肌缺血再灌注模型(实验组),缺血前静脉注射右美托咪定预处理10min,且切断迷走神经。动物麻醉后,于左股动脉处置管以记录血压,并于四肢皮下插入针形电极导出心电图。通过冠脉结扎法给予心脏缺血处理,30min后进行再灌注,再灌注时间为180min。血压记录显示降低20mmhg且心电图显示s-t段升高表示缺血成功;血压及心电图逐渐恢复表示再灌注成功。再灌注结束后抽取血清,并快速取左室心肌组织。2、心肌组织采用甲醛固定、石蜡包埋与切片处理,通过伊红-苏木素(he)染色观察心肌形态,炎性细胞浸润等,并计算心梗面积。3、比色法检测心肌组织与血浆中肌酸激酶(ck)、乳酸脱氢酶(ldh)的含量。4、采用elisa法测定各组血清中tnf-α、il-1β、il-6、hmgb1的含量。5、研磨心肌组织提取蛋白。免疫印迹(westernblot)方法检测组织中凋亡因子bcl-2、bax、caspase-3及信号分子α7nachr、p65、ikb-a的表达。第二部分胆碱能抗炎通路介导右美托咪定抗心肌缺血再灌注损伤的研究1、构建t钙通道高表达与低表达慢病毒载体,分别经鞘内注射转染。将t钙通道高表达与低表达大鼠分别输注右美托咪定(dex组)和生理盐水(对照组),注药后利用脑片检测细胞内钙离子浓度变化和乙酰胆碱活性。2、取20只t钙通道高表达大鼠与20只t钙通道低表达大鼠进行心肌缺血再灌注,并分别在缺血再灌注时注射右美托咪定(dex组)和生理盐水(对照组),每组10只。检测各组心肌损伤指标:心梗面积;血浆中肌酸激酶(ck)、乳酸脱氢酶(ldh)的含量;血清中tnf-α、il-1β、il-6、hmgb1的含量。3、取30只大鼠分为3组,对照组10只不做处理,低a7nacha组10只使用a7nach受体拮抗剂a-银环蛇毒素处理,高a7nach组10只使用a7nach受体激动剂gts-21处理。3组大鼠进行心肌缺血再灌注,且均进行10min的右美托咪定预处理。检测各组心肌损伤指标:心梗面积;血浆中肌酸激酶(ck)、乳酸脱氢酶(ldh)的含量;血清中tnf-α、il-1β、il-6、hmgb1的含量。4、lps诱导乳鼠心肌细胞炎症,si-rna沉默α7nachr。检测炎性因子tnf-α、il-1β、il-6、hmgb1的rna表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡;并检测p65、bcl-2、bax等因子表达。第三部分右美托咪定对临床心肌缺血再灌注损伤患者的保护作用选取2013年3月-2014年8月治疗的64例cabg手术患者,对其临床资料进行统计分析,将病人分为两组,实验组为手术时进行注射右美托咪定,对照组则注射生理盐水处理。分别于入室时、主动脉开放后0min(t1)、15min(t2)、2h(t3)和24h(t4)检测记录病人平均动脉压(map)和心率(hr),并采集病人血清。比色法检测血清中ctni和ck-mb含量,elisa法测定血清中tnf-α、il-6、il-8、il-10的含量。结果:1、右美托咪定对大鼠心肌缺血再灌注组织损伤的保护作用(1)组织形态学结果显示:右美托咪定处理后,由心肌缺血再灌注引起的心肌组织损伤明显减轻,组织形态相对完整、组织细胞凋亡坏死减少、且炎性细胞浸润明显减轻、心梗面积明显减少。(2)右美托咪定处理后,心肌缺血再灌注大鼠血清中肌酸激酶(ck)、乳酸脱氢酶(ldh)的水平明显下降,统计学差异显著。(3)右美托咪定处理后,心肌缺血再灌注大鼠血清中tnf-α、il-1β、il-6、hmgb1的含量明显降低,统计学有显著性差异。(4)右美托咪定处理后,心肌缺血再灌注大鼠心肌组织中促凋亡因子bax、凋亡蛋白caspase-3的表达明显下降,而抗凋亡因子bcl-2的表达明显上升。2、胆碱能抗炎通路介导右美托咪定抗炎抗心肌缺血再灌注损伤中的研究。(1)心肌缺血再灌注模型中右美托咪定处理但切断迷走神经的大鼠其抗心肌缺血再灌注损伤作用明显减弱(心梗面积较dex组增大;ldh、ck含量较dex组上升;tnf-α、il-1β、il-6、hmgb1的水平较dex组上升)。(2)心肌缺血再灌注模型中右美托咪定处理但切断迷走神经的大鼠心肌组织中α7nachr、ikb-a的表达明显下调,p65的表达明显上升(较dex组)。(3)大鼠中t钙通道高表达,可起到与右美托咪定处理类似的提高细胞内钙离子浓度及增强乙酰胆碱活性的作用;而当大鼠中t钙通道低表达,则可明显减弱右美托咪定处理引起的细胞内钙离子浓度上升及乙酰胆碱活性增强。(4)大鼠中T钙通道高表达,可起到与右美托咪定处理类似的抗缺血再灌注损伤作用;而当大鼠中T钙通道低表达,则可明显减弱右美托咪定的抗缺血再灌注损伤作用。(5)使用a7nAch受体拮抗剂a-银环蛇毒素处理的大鼠,右美托咪定的抗心肌缺血再灌注损伤作用明显减弱(心梗面积较Dex组增大;LDH、CK含量较Dex组上升;TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1的水平较Dex组上升);使用a7nAch受体激动剂GTS-21处理的大鼠则可与右美托咪定处理起到同样的抗心肌缺血再灌注损伤作用。(6)在乳鼠心肌细胞中使用LPS诱导炎症,沉默α7 nAChR后,发现炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1的水平明显上调;细胞凋亡比例明显上升;促凋亡因子bax、凋亡蛋白caspase-3的表达明显下降,而抗凋亡因子bcl-2的表达明显上升;NF-κB信号通路分子p65的表达明显上调,NF-κB信号通路抑制分子IkB-a的表达明显下调。3、右美托咪定对临床病人心肌缺血再灌注的保护作用(1)相对于对照组,实验组患者MAP和HR处于较为正常水平。(2)相对于对照组,实验组血清中cTnI和CK-MB含量较低。(3)相对于对照组,实验组血清中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10的含量较低。结论:本文运用大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,并在手术前进行右美托咪定处理,对缺血再灌注后大鼠心肌组织损伤、炎性反应、细胞凋亡、胆碱能信号通路分子等进行检测和分析,并在临床样本资料中加以分析验证。得到以下结论:1、右美托咪定能明显减轻大鼠心肌缺血再灌注诱导的心肌组织损伤。2、右美托咪定通过活化T型钙通道提高细胞内钙离子浓度,进而兴奋迷走神经激活胆碱能抗炎通路,增强乙酰胆碱活性来减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。3、右美托咪定可通过激活胆碱能抗炎通路来减轻临床病人心肌缺血再灌注损伤。