胃癌是我国主要的恶性肿瘤之一,发病率及死亡率均仅次于肺癌位居次席。目前确诊的胃癌,大部分都处于进展期,根治术后5年生存率长期徘徊在20-30%,恶性程度高、预后差。因此,进一步阐明胃癌发病的分子机制,寻找理想的早期诊断标志物,以及高效特异的治疗靶点,已经成为当今胃癌研究中的重大问题。微小RNA是一种内源小分子非编码RNA,其可与靶基因的3’UTR不完全互补结合,从而直接降解靶m RNA或抑制靶m RNA的翻译。近年来大量研究表明,miRNA参与了人体内几乎所有生理过程,如细胞的发育分化、增殖和凋亡。更重要的是,miRNA被发现对多种人类癌症的发病机理也有影响,因此,寻找miRNA分子及其靶基因的研究已成为基因调控研究领域的重要分支和热点。有研究发现,某些miRNA表达水平在胃癌和癌旁正常组织中存在显著差异,并与胃癌浸润深度、组织学类型及患者预后等临床指标密切相关。为了深入研究miRNA在胃癌发生发展过程中发挥的作用,本研究对100种miRNA进行了高通量功能筛选,最终选定了抑制细胞迁移能力最强的miR-451,检测其在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达量,然后研究了miR-451对胃癌细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移侵袭、EMT的影响,并对miR-451的靶基因进行预测鉴定,最后检测其下游靶基因ERK2对胃癌细胞生物学行为的作用。第一部分:高通量功能筛选对胃癌细胞迁移有影响的miRNA目的:高通量功能筛选与胃癌细胞迁移相关的miRNA。方法:通过SAMcell技术在人胃癌细胞系SGC-7901中对100种miRNA进行高通量功能筛选。结果:确定了22种在胃癌中有功能的miRNA,其中15种抑制迁移,7种促进迁移,在抑制迁移的miRNA中,相对于对照组,miR-451的差异倍数最低。结论:在待选miRNA中,miR-451明显影响胃癌细胞生物学行为。第二部分:胃癌组织及胃癌细胞系中miR-451的表达目的:检测miR-451在胃癌组织及其配对的癌旁正常组织中的表达差异。检测miR-451在正常胃黏膜上皮细胞株及三种胃癌细胞株中的表达量。方法:收集20例胃癌患者手术切除标本,利用RT-q PCR检测miR-451在胃癌组织及其配对的癌旁正常组织中的表达差异情况。提取GES-1、BGC-823、HGC-27、SGC7901细胞株中的RNA,用实时荧光定量PCR检测miR-451的表达。结果:1 miR-451在癌组织中的表达显著低于配对的癌旁正常组织。2 miR-451在胃癌细胞系中的表达低于正常胃黏膜上皮细胞株GES-1。结论:miR-451在胃癌中表达下调,提示其可能在胃癌发生发展过程中发挥重要作用。第三部分:miR-451对胃癌细胞生物学功能的影响目的:研究miR-451对胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移、侵袭、EMT等生物学行为的影响。方法:应用瞬时转染的方法将miR-451转入胃癌细胞株以获得高表达的miR-451的细胞模型,并用RT-q PCR验证转染效果;然后用CCK-8方法及EDU方法检测肿瘤细胞的增殖情况,用Annexin V/PI双染通过流式细胞仪检测凋亡,用流式细胞仪检测细胞周期变化,用transwell试验检测细胞迁移和侵袭,通过免疫荧光检测细胞中上皮细胞标志物(E-cadherin)和间充质标志物(vimentin)的表达,来反映EMT过程。结果:1选择SGC-7901细胞作为体外细胞模型,利用Real-time q PCR检测转染miR-451 mimics和阴性对照48h后miR-451的表达,结果显示:转染miR-451 mimics后SGC-7901细胞中miR-451的表达水平较阴性对照组显著增高(P<0.01)。2 CCK8方法和EDU方法均提示在胃癌细胞SGC-7901中,miR-451表达水平的上调可抑制细胞增殖。3流式细胞仪分析双染Annexin V和PI的SGC-7901细胞凋亡比例,结果显示:miR-451 mimics实验组的凋亡细胞比例为21.36%,而阴性对照组有6.87%的细胞发生了凋亡,表明miR-451可以诱导胃癌细胞凋亡。4流式细胞仪检测细胞周期,结果示:miR-451 mimics实验组的G1/G0期、S期和G2/M期的比例分别为55.31%、21.62%和19.89%,而阴性对照组三期的比例分别为45.76%、22.97%和26.87%,表明miR-451表达水平的上调可阻滞细胞于G1期。5用transwell迁移实验检测过表达miR-451对SGC-7901细胞迁移能力的影响,结果示:miR-451 mimics实验组迁移细胞数为(343.3±6.6)个,而阴性对照组为(520.6±7.6)个,两组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)。表明miR-451可以抑制胃癌细胞迁移。6用transwell侵袭实验检测过表达miR-451对SGC-7901细胞侵袭能力的影响,结果示:miR-451 mimics实验组侵袭细胞数为(373.3±7.6)个,而阴性对照组为(523.3±13.3)个,两组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)。表明miR-451可以抑制胃癌细胞侵袭。7和阴性对照组相比,miR-451 mimics实验组中E-cadherin的表达增高,vimentin的表达降低,表明miR-451可以起到抑制EMT过程的作用。结论:miR-451在胃癌细胞中发挥抑癌作用,影响胃癌的增殖、凋亡、转移等生物学行为。第四部分:miR-451靶基因的预测和验证目的:寻找miR-451的靶基因,为深入研究miR-451的分子机制奠定基础。方法:应用生物信息学软件对miR-451的靶基因进行预测和筛选,利用双荧光素酶报告基因方法验证预测的靶基因,运用RT-q PCR和western blot检测过表达miR-451后ERK2分别在m RNA和蛋白水平表达的变化。结果:1应用生物信息学软件对miR-451的靶基因进行预测,结果示:ERK2可能为miR-451的靶基因。2双荧光素酶报告基因方法证明miR-451可以靶向作用于ERK2的3’UTR。3 RT-q PCR和western blot证明SGC-7901细胞过表达miR-451后,ERK2在m RNA和蛋白水平的表达均下调。结论:在胃癌中,ERK2是miR-451的下游靶基因。第五部分:沉默ERK2对胃癌细胞生物学功能的影响目的:研究miR-451的下游靶基因ERK2对胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡、周期、迁移、侵袭、EMT等生物学行为的影响,分析miR-451是否是通过ERK2影响胃癌细胞生物学行为。方法:首先合成ERK2的si RNA,分别用实时荧光定量PCR和western blot在m RNA和蛋白水平验证其沉默效率,应用瞬时转染的方法将其转入SGC-7901胃癌细胞以获得低表达的ERK2细胞模型,然后用CCK-8方法及EDU方法检测肿瘤细胞的增殖情况,用Annexin V/PI双染通过流式细胞仪检测凋亡,用流式细胞仪检测细胞周期变化,用transwell试验检测细胞迁移和侵袭,通过免疫荧光检测细胞中上皮细胞标志物(E-cadherin)和间充质标志物(vimentin)的表达,来反映EMT过程。结果:1 RT-q PCR和Western blot结果示:转染ERK2 si RNA后,ERK2在m RNA水平和蛋白水平的表达较阴性对照组均显著降低。2 CCK8方法和EDU方法均提示在胃癌细胞SGC-7901中,沉默ERK2可抑制SGC-7901细胞增殖。3流式细胞仪分析双染Annexin V和PI的SGC-7901细胞凋亡比例,结果显示:si-ERK2实验组的凋亡细胞比例为13.96%,而阴性对照组有6.87%的细胞发生了凋亡,表明下调ERK2的表达可以诱导胃癌细胞凋亡。4流式细胞仪检测细胞周期,结果示:si-ERK2实验组的G1/G0期、S期和G2/M期的比例分别为55.29%、21.73%和19.11%,而阴性对照组三期的比例分别为45.76%、22.97%和26.87%,表明下调ERK2的表达可阻滞细胞于G1期。5用transwell迁移实验检测沉默ERK2对SGC-7901细胞迁移能力的影响,结果示:si-ERK2实验组迁移细胞数为(454±12.0)个,而阴性对照组为(520.6±7.6)个,两组比较差异有统计学意义(p<0.05)。表明ERK2表达水平的下调可以抑制胃癌细胞迁移。6用transwell侵袭实验检测沉默ERK2对SGC-7901细胞侵袭能力的影响,结果显示:si-ERK2实验组侵袭细胞数为(410.7±24.1)个,而阴性对照组为(523.3±13.3)个,两组比较差异有统计学意义(p<0.05)。表明ERK2表达水平的下调可以抑制胃癌细胞侵袭。7和阴性对照组相比,si-ERK2实验组中E-cadherin的表达增高,vimentin的表达降低,表明沉默ERK2可以起到抑制EMT过程的作用。结论:miR-451通过调控癌基因ERK2影响胃癌的生物学行为。