背景肠黏膜屏障在预防微生物及毒素由肠腔侵入机体方面发挥重要作用。在炎症性肠病(IBD)过程中,肠道屏障功能显著受损,菌群失调,大量内毒素和(或)病原微生物等经受损肠黏膜进入体循环,通过多种机制增加肠通透性,诱发和(或)加重肠道炎症和免疫反应。因此,修复肠黏膜屏障有利于控制或减轻肠黏膜炎症和免疫反应,是治疗IBD的重要方法之一。5-ASA类药物是目前治疗溃疡性结肠炎的常用药物,其中巴柳氮是新型5-ASA类药物,可以在肠道细菌偶氮还原酶作用下释放5-ASA,对轻中度溃疡性结肠炎具有显著的诱导缓解作用,但其是否能改善肠黏膜通透性国内外尚无报道。因此探讨巴柳氮对结肠炎小鼠肠黏膜通透性的影响及其作用机制对治疗溃疡性结肠炎(UC)药物的评价和UC发病机制的研究均具有重要的理论和实际意义。目的用C57BL/6J小鼠建立DSS诱导的溃疡性结肠炎模型,研究UC小鼠肠黏膜通透性的改变,并在此模型基础上研究巴柳氮对结肠炎小鼠肠黏膜通透性的影响及其可能的作用机制。方法(1)小鼠结肠炎模型的建立:C57BL/6J小鼠自由饮用5%DSS溶液1周,每日行DAI评分,实验结束后进行结肠HE染色评分和结肠匀浆检测MPO活性。(2)巴柳氮对结肠炎小鼠肠黏膜通透性的影响及其作用机制研究:将45只C57BL/6J小鼠用随机方法分成5组:正常对照组、DSS模型组、巴柳氮低剂量组、巴柳氮中剂量组、巴柳氮高剂量组。正常对照组自由饮水,DSS模型组、巴柳氮3个剂量组从实验第1天开始自由饮用5%DSS溶液,共7天。参考有关文献,巴柳氮给药剂量根据小鼠体重计算,分别为42 mg/kg、141 mg/kg、423 mg/kg,巴柳氮用蒸馏水溶解后灌胃给药,正常对照组和DSS模型组用等量蒸馏水灌胃,给药时间共7天。每日行DAI评分,实验结束后取结肠进行HE染色评分,结肠匀浆检测MDA含量、MPO、SOD、GSH-Px活性,小肠黏膜透射电镜检查和免疫组化检测E-钙粘蛋白和VCAM-1蛋白的表达,小肠匀浆检测TNF-α和IFN–γ含量。制备小肠肠囊,采用Evans蓝方法检测小肠黏膜通透性。建立DSS损伤Caco-2细胞模型及观察巴柳氮对DSS损伤Caco-2细胞模型的影响。结果(1)C57BL/6J小鼠自由饮用5%DSS溶液1周后出现明显体重减轻、便血和腹泻,DAI评分和HI评分增高(P<0.01),同时结肠黏膜MPO活性明显增高(P<0.05)。正常对照组小鼠体重无明显减轻、大便性状正常,DAI评分、HI评分和结肠黏膜MPO活性均无明显增高。(2)巴柳氮组小鼠一般情况明显改善,DAI评分和HI评分与DSS模型组小鼠相比,明显降低(P<0.05),结肠黏膜MPO活性减低。DSS模型组小鼠和正常对照组相比,SOD、GSH-Px活性明显降低, MDA、TNF-α和IFN-γ含量明显增高(P<0.05)。透射电镜检查小鼠回肠黏膜上皮细胞形态改变,绒毛变短、萎缩、稀疏、排列极不规则,细胞间连接复合体缩短、变宽,细胞间隙扩大。免疫组化检查E-钙粘蛋白表达减少,而VCAM-1表达增强;小肠组织中Evans蓝含量增高。巴柳氮组SOD、GSH-Px活性增高,MDA、TNF-α和IFN–γ含量明显降低(P<0.05),回肠黏膜上皮细胞形态结构改善,绒毛排列整齐、密集,细胞连接结构清晰、紧密程度增高,E-钙粘蛋白表达增强,而VCAM-1蛋白表达减少,小肠组织中Evans蓝含量明显减少(P<0.05)。DSS对Caco-2具有明显的损伤作用,不同浓度的巴柳氮给药可明显减轻DSS对Caco-2的损伤,表明巴柳氮对肠上皮细胞具有一定的细胞保护作用。结论(1)成功建立了小鼠DSS结肠炎模型,为UC发病机制和治疗药物的研究提供实验基础。(2)巴柳氮可改善结肠炎小鼠DAI评分及HI评分,具有显著的抗结肠炎作用。(3)结肠炎小鼠肠黏膜超微结构与通透性明显受损,巴柳氮可显著改善肠黏膜超微结构和肠黏膜通透性。(4)巴柳氮修复肠黏膜屏障与抗结肠炎作用显著相关,机制可能与抗氧化,细胞免疫调节等有关。背景肠黏膜屏障是机体最重要的屏障之一,能够阻止病原微生物及毒素产物由肠腔侵入机体。在IBD过程中,肠黏膜屏障功能破坏,导致肠道内细菌、内毒素易位,通过多种机制增加肠通透性,诱发和(或)加重肠道炎症和免疫反应,促进肠源性感染的发生与发展,甚至多系统器官功能衰竭的发生。修复肠黏膜屏障有利于控制或减轻肠黏膜炎症和免疫反应,防止严重并发症,是治疗IBD的重要方法之一。因此早期对肠黏膜屏障功能进行检测并正确诊断具有十分重要的临床价值。目前国外通过应用放射性核素标记的大分子口服液检测患者肠黏膜通透性,肠镜活检黏膜组织观察上皮细胞结构的改变等方法,多为有创性检查,或存在敏感性和(或)特异性不高等缺点。高效液相色谱法检测受试者口服乳果糖和甘露醇口服液后尿中乳果糖、甘露醇排出比值(L/M)评估肠黏膜通透性,是一种无创的诊断肠黏膜屏障功能的方法,其诊断的敏感性和特异性均较高,已广泛应用于临床。目前有关采用高效液相色谱示差法检测UC患者肠黏膜通透性的研究尚未见报道。另一方面,肠黏膜通透性的改变可以发生在肠道出现显著的炎性损伤前,当肠道炎症明显加重时,肠黏膜通透性进一步增加。肠黏膜通透性的改变与疾病的复发缓解和病情轻重相关,早期采取措施保护肠黏膜屏障功能,有助于控制病情,提高疗效。因此,检测UC患者肠黏膜通透性,有助于预测UC患者的疾病活动程度和治疗效果。本研究在探讨UC患者肠黏膜通透性检测的同时,将肠黏膜通透性的改变和UC患者临床症状评分进行相关分析,探讨肠黏膜通透性的改变反映UC患者疾病活动程度的敏感性。目的建立HPLC示差法评价溃疡性结肠炎患者肠黏膜通透性的改变,分析UC患者肠黏膜通透性的改变、ESR、CRP和Sutherland DAI评分之间的相关性,探讨肠黏膜通透性反映UC患者疾病活动程度的敏感性。方法(1)建立用高效液相色谱-示差检测器测定尿中乳果糖、甘露醇含量的方法。尿样经过高速离心、离子交换处理后在hypersil NH2柱(4.6 mm x 250mm,5um)上,以乙腈、水(体积比80:20)为流动相,示差检测器检测。(2)收集15例UC患者和15例健康对照者口服乳果糖和甘露醇测试液50ml后6小时内尿液,用HPLC-示差法检测尿样中L、M含量,计算L/M比值,比较UC患者和健康对照者肠黏膜通透性的改变。(3)分析UC患者肠黏膜通透性和ESR、CRP、Sutherland DAI评分之间的相关性,比较L/M、ESR和CRP在反映UC患者疾病活动程度的敏感性。结果(1)HPLC示差法能很好分离乳果糖、甘露醇,乳果糖高中低3个浓度的回收率分别为94.88%,89.68%和86.91%;甘露醇高中低3个浓度的回收率分别为94.39%,88.92%和83.39%。乳果糖和甘露醇的进样量在0.05 -5g/L范围内时,线性关系良好。5g/L、1.25g/L、0.15625g/L三个浓度的乳果糖和甘露醇尿液标准样品日内变异系数、日间变异系数均小于15%(n=5)。本方法测定乳果糖和甘露出最低检测浓度为50mg/L。(2) 15例UC患者尿中L/M比值为0.494±0.190,明显高于15例健康对照者尿中L/M比值(0.039±0.014,P<0.05)。表明UC患者肠黏膜通透性明显高于健康对照者。(3)UC患者肠黏膜通透性的改变和Sutherland DAI评分间有良好的相关性,左半结肠病变UC患者ESR、CRP均在正常范围,但左半结肠肠黏膜通透性增高(P<0.05)。结论(1)HPLC示差法检测UC患者尿中乳果糖和甘露醇,线性关系良好,专属性、精密度、绝对回收率和敏感性高。(2)UC患者肠黏膜通透性和健康对照者相比明显增高。乳果糖/甘露醇排出比值能正确地反映患者肠黏膜通透性的改变。(3)UC患者肠黏膜通透性的改变能反映UC疾病活动程度,敏感性高于ESR、CRP。