牙周病是一种慢性进行性疾病,逐渐破坏牙周支持组织,最终导致牙齿丧失。牙周病治疗的目的不仅在于控制炎症,同时希望使已经破坏的牙周组织再生以形成新附着。外伤、肿瘤、先天性唇腭裂等疾病均可引起牙槽骨的缺失。牙周组织的重建包括重建因炎症破坏吸收的硬组织(牙骨质牙槽骨)和软组织(牙龈牙周膜)。重建了牙周组织,才能使牙周组织恢复原有的结构,才能恢复其原有的功能。牙周组织再生诱导术(Guided tissue regeneration, GTR)作为牙周炎患者牙槽骨再生治疗的一种有效方法,在临床中常与骨移植材料併用治疗大面积牙槽骨缺损。其中,使用自体骨移植即可提供成骨细胞及促进其前体细胞黏附又不存在外来物质引起的免疫排斥反应,是骨修复治疗的金标准。然而由于自体骨来源有限、采集自体骨带来的一系列并发症、易被吸收等问题,使得人们迫切需要开发理想的骨替代物。日益发展的组织工程技术为开发可替代自体骨的人工材料的提供了可能。骨组织工程通过仿生技术制造出与骨构造相近的一系列人工骨材料,骨中矿物质主要为(85%)羟基磷灰石,其余为碳酸钙(10%),氟化钙(2-3%)和氟化镁(2-3%)。而骨基质蛋白主要由胶原组成,其次为非胶原蛋白包括糖蛋白,蛋白聚糖和生长因子。胶原蛋白占骨基质蛋白的90%,主要为I型胶原蛋白(97%),其余为少量Ⅲ, Ⅴ, Ⅴ,Ⅺ和XIII型胶原蛋白。常用的骨修复支架材料包括磷酸钙盐支架如磷酸三钙(TCP)以及羟基磷灰石(HA),天然的细胞外基质支架包括胶原、藻酸盐、骨基质明胶等。然而,单一的支架材料有其自身的不足与缺陷。如磷酸三钙材料,其具有良好的生物相容性并且具有一定的物理强度,是良好的支架材料。然而其弹性及可塑性差,不易被细胞粘附,影响了其临床使用及成骨效果。另一方面,由天然的细胞外基质如胶原,其生物相容性、可塑性良好,具有一定的弹性和黏附能力,易被组织吸收。然而,其吸收速率过快,物理强度差,亦影响了其使用。在最近的研究中,我们发现通过复合多种材料,结合多种材料的优点取长补短,其性能可较单一材料有大幅度提高。α-磷酸三钙材料(a-Tricalcium Phosphate, a-TCP)已被证明具有良好的骨引导能力,并且已在临床上广泛应用。然而,在临床上发现α-磷酸三钙材料易于残留在缺损部位,易引起炎症反应,影响骨愈合。同时,传统磷酸三钙材料的脆性及弹性模量较大,韧性和弹性不足从而很难塑成理想的.形状,然而直接植入颗粒粉末状磷酸三钙材料易导致材料的移位分散和流失。本实验室前期的研究发现,α-磷酸三钙具有良好的骨再生诱导能力,但其骨组织改建时间长,较多材料残留在新生骨组织中。通过复合胶原材料,利用胶原材料的特性,则可使人工骨材料具有超常的表面特性及特殊的生物活性,其塑形性、韧性等得到较大提高,可解决传统材料在临床应用的许多弊端,而成为更理想的骨替代材料和骨组织工程的支架。本实验拟采用大鼠头盖骨临界性骨缺损模型,在α-磷酸三钙中加入易于分解吸收的胶原,探讨α-磷酸三钙与胶原混合材料的骨缺损修复效果,从而为提高复合材料修复骨缺损的临床应用研究提供实验依据。通过将新型α-磷酸三钙／胶原复合体骨替代材料植入大鼠头盖骨极限骨缺损,探讨a-磷酸三钙／胶原复合体修复大鼠头盖骨骨缺损能力及其作为自体骨移植替代物的可能性,揭示影响骨替代材料降解性能和成骨性能的相关因素。为临床应用提供实验依据,从而获得具有广阔应用前景的新型骨修复材料。材料与方法：实验-：将5cm×5cm大小α-磷酸三钙(80%孔隙率,空隙直径200mm)粉碎为大小10-200μm的多孔α-磷酸三钙颗粒。胶原是由猪皮中提取并经胃蛋白酶处理。接着,α-磷酸三钙颗粒与胶原以150mg/ml的浓度比合成的匀浆α-磷酸三钙/胶原溶液。然后将匀浆倒入塑料模具(9mm×9mm×1mm),立即冷冻至-80。,冷冻干燥24h。冻干后的α-磷酸三钙/胶原复合体类似于海绵状结构,随后将其放于140。真空中使其发生交联反应。制成的材料成白色海绵状,于扫描电子显微镜下观察可见胶原成网状交织于α-磷酸三钙周围实验二：实验所用细胞为人骨髓间充质干细胞的培养。在加入10%F13S和1%双抗(青霉素和链霉素)的DMEM中培养细胞,将细胞置于37℃细胞培养箱中培养,每两天换液一次。将支架材料正反面分别进行紫外线照射消毒半h,细胞培养液浸泡1h预湿支架后将细胞(1.0×105细胞/支架)接种于支架上。细胞/支架置于含5%CIO2的37℃细胞培养箱中培养,72h后取出,用磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗两次。4%戊二醛固定半h后放入酒精脱水,最后使用h后取出扫描电镜观察。实验三：选取由清水动物实验中心提供的8周SD大鼠28只,体重为250-280g。24只大鼠用于移植骨材料,并将其随机分为4,6,8周3组。大鼠麻醉使用腹腔内注射30mg/kg戊巴比妥钠,头部用消毒聚维酮碘消毒,脱毛备皮,用慢速骨钻于头盖骨正中联合部下方形成一个9mm×9mm×1mm大小骨缺损。一组大鼠放入α-磷酸三钙/胶原复合体材料(12只)作为实验组；另一组将取出的自体骨骨片粉碎,放入缺损区(12只)作为对照组；最后一组不放入任何材料为空白组并于8周后处死回收(4只)。在所有大鼠中使用吸收性GTR膜覆盖手术缺损部。严密分层缝合肌肉皮肤。术后给予实验动物普鲁卡因青霉素15万单位肌肉注射,每天1次,共3d。常规条件下喂养观察。在手术后第4,6,8周,采用大剂量戊巴比妥钠(120mg/kg)处死动物,取下分离头盖骨,4%多聚甲醛固定,Micro-CT拍摄三维CT图像。获取三维头盖骨图像后利用形态学指标分析软件计算缺损部骨体积分数(BV/TV, Bone volume fraction/total volume),骨密度(BMD, Bone mineral density),骨矿含量分数(BMC/TV, Bone mineral content/total volume)情况来评价骨生成情况。实验四：将标本用川本法获取非脱钙骨切片,然后行HE(苏木精伊红染色,Hematoxylin-eosin staining), TRAP (抗酒石酸酸性磷酸酶,Tartrate resistant acid phosphatase), ALP(碱性磷酸酶,Alkaline phosphatase)。在手术后第4,6,8周,注射钙黄绿素(5 mg/kg),四环素(25 mg/kg)以及25 mg/kg茜素红以标记各周间骨生长速度。将标本用川本法获取非脱钙骨切片,与激光显微镜下观察切片中骨中矿物质沉积情况。实验五：在手术后第4,6,8周标本切片行RANKL(核因子KB受体活化因子配体,Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)免及TNF-α(肿瘤坏死因子-α,Tumor Necrosis Factor-α)免疫染色；显微镜下观察拍片。结果：1.α-磷酸三钙/胶原复合体肉眼观察为白色多孔海绵状材料。扫描电镜结果显示实验组材料为珊瑚状多孔结构,孔径约为100～300μm,同时可见大量丝状胶原作为支架结构支撑材料。2.细胞在α-磷酸三钙／胶原复合体材料上形成伪足,紧密粘附与材料表面；细胞生长状态较好,同时细胞与细胞之间连接紧密,证明细胞可在含有的胶原的α-磷酸三钙／胶原复合体局部微环境中黏附和生长及发挥成骨特性。3.术后6周,CT影像纵面图像可见自体骨移植组可见缺损部骨组织生成,骨缺损面积减少,新生骨密度接近于周围骨组织；不能清晰分辨骨缺损边缘及植入自体骨材料。横断面图像可见缺损部植入的自体骨相互连接形成骨片,骨缺损低密度影像面积减少。α-磷酸三钙／胶原复合体组纵面图像可见骨缺损面积减少,材料中有明显骨生成影像。横断面图像可见材料中高密度新生骨影像进一步增大。8周,CT影像纵面图像可见自体骨组骨缺损面积增大,出现明显的骨吸收现象,中心部见少量骨质残留。横断面可见高密度骨影像减少,低密度软组织影像面积增大。α-磷酸三钙／胶原复合体材料组纵面图像未见明显骨吸收现象,缺损部大部分被新生骨修复。空白组骨缺损只见边缘少量骨生成。术后8周材料组的骨体积分数(BV/TV)与自体骨组差异有统计学意义(p<0.01),材料组(均数为69.7%)高于自体骨组(均数为42.475%)。 4,6周时,材料组和自体骨组的BV/TV值、BMD值、BMC/TV值差异无统计学意义。8周时,2组间的BV/TV值、BMD、BMC/TV值差异均有统计学意义。4.HE染色：4周,HE染色结果显示自体骨及α-磷酸三钙/胶原复合体被纤维结缔组织包绕,α-磷酸三钙/胶原复合体中心可见新生骨结节。6周,HE染色可见α-磷酸三钙/胶原复合体和自体骨组均出现较多新生骨,骨小梁之间形成骨髓腔。8周,HE染色显示自体骨移植组中,移植自体骨及其周边新生骨多数被吸收,周围纤维结缔组织长入吸收后的骨陷窝中；α-磷酸三钙/胶原复合体组中可见大量骨生成,未见α-磷酸三钙/胶原复合体材料残留,新生骨与缺损周边骨界限难以分辨；空白组骨缺损边缘可见少量骨生成,缺损大部份被纤维结缔组织充填。ALP染色：4周ALP染色图片可见自体骨组与材料组均可见骨缺损部材料周边ALP高表达,显示植入材料周围有大量活跃的成骨细胞分泌大量骨基质参与骨缺损修复。6周ALP染色图片显示此时材料组中ALP表达较自体骨组强,显示此时成骨细胞在α-磷酸三钙/胶原复合体组中更为活跃。8周两组中都显示较少ALP表达,显示8周时成骨趋缓,缺损部位骨生长停滞。TRAP染色：4周时自体骨和材料组见均可见骨髓腔中出现少量破骨细胞参与骨吸收；材料组中可见细胞倾向于附着在骨组织上,而材料上附着的破骨细胞较少,植入α-磷酸三钙/胶原复合体材料与自体骨部分降解吸收,两组TRAP染色只见少数的破骨细胞。6周时TRAP染色切片显示此时自体骨组新生骨骨髓腔中出现大量破骨细胞,并形成吸收陷窝,而α-磷酸三钙／胶原复合体材料组新生骨中只见少数破骨细胞。8周TRAP染色切皮显示自体骨组仍可见大量破骨细胞,骨吸收活跃；α-磷酸三钙／胶原复合体材料组只见少数破骨细胞,未见明显骨吸收现象。骨中矿物质沉积情况：4周至6周间材料组大鼠缺损部骨沉积速度较自体骨组快,矿化表面新骨形成骨纵向生长较快；6周至8周大鼠头盖骨缺损部矿化速度下降、 成骨活性亦有所降低,矿化表面新骨形成有所减少,骨生长较4周至6周缓慢。5. RANKL免疫染色：从RANKL染色可以看出术后各周均可见自体骨组群损部周围纤维组织中RANKL高表达,而材料组在4,6周表达较强而8周表达较弱。RANKL在促进破骨细胞分化,促进骨吸收中具有重要作用。在自体骨中见到的RANKL高表达可引起大量破骨细胞生成积聚,吸收植入的自体骨及新生骨。而在α-磷酸三钙/胶原复合体组中RANKL表达较弱,可以说明材料引起较少的RANKL表达,从而引起较少的破骨细胞生成,骨吸收亦较少。TNF-α免疫染色：从RANKL染色可以看出术后6周起均自体骨组群损部周围纤维组织中TNF-α高表达,而材料组在4周表达较强而6,8周表达较弱。肿瘤坏死因子可在RANKL存在的前提下强烈促进破骨细胞生成,使破骨细胞大量吸收骨组织。在图中可见,自体骨6周后的TNF-α高表达亦是引起大量破骨细胞生成并造成新生骨吸收的重要原因之一。另外,在材料组中,6周起未见明显的TNF-α表达,在骨生成中未明显受到TNF-α影响。结论：1.使用冻结干燥法合成的多孔海绵状a-磷酸三钙/胶原复合体具有与骨组织类似的三维多孔结构,材料富有弹性,同时具有一定硬度易于塑形。细胞可在含有的胶原的a-磷酸三钙/胶原复合体局部微环境中黏附和生长。2.体内实验证明α-磷酸三钙/胶原复合体具有良好的体内生物相容性,生物降解性,骨传导性和生物活性。具有较好的骨缺损修复能力,材料易于吸收。3.α-磷酸三钙/胶原复合体较少引起炎症反应,在新生骨中未见明显破骨细胞生成,成骨效果稳定。