论文部分内容阅读
第1章C/EBPα表达异常在APL细胞分化阻滞及ATRA耐用中的作用研究背景CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT enhancer binding protein alpha, C/EBPα)是髓系分化过程的重要调控因子,对造血细胞的分化命运起决定作用。C/EBPα表达减低引起的髓系分化阻滞参与了M3型(即APL)、AML1-ETO阳性的M2型及CBFB-MYH11阳性的M4型等类型的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的发生。我们通过蛋白免疫印迹技术发现在全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid, ATRA)耐药的APL细胞中与ATRA敏感的APL细胞中C/EBPα蛋白的表达水平有明显差异。C/EBPα蛋白表达异常在APL细胞耐药中的作用国内外未有研究,有望成为耐药的APL治疗的新靶点。目的本部分旨在研究C/EBPα蛋白在ATRA耐药的APL细胞中异常表达的原因,及其在APL细胞对ATRA耐药中的作用；研究恢复C/EBPα蛋白对耐药的APL细胞的诱导分化作用及对全反式维甲酸敏感性的恢复,为APL耐药及复发的预防和诱导缓解治疗提供思路。方法本部分通过蛋白免疫印迹技术检测ATRA耐药株及敏感株中C/EBPα蛋白42KDa及30KDa形式的差异表达及相关通路活化水平；通过慢病毒表达载体pLenti-CEBPA-WT或pLenti-CEBPA-P30在ATRA耐药的APL细胞株NB4-R1中分别恢复42KDa及30KDa形式C/EBPα蛋白,以感染慢病毒空载体细胞作为对照,通过流式细胞术检测不同亚株的粒系分化抗原表达的改变,聚合酶链反应检测分化相关基因表达；不同细胞亚株经过ATRA处理,通过检测细胞分化及观察形态学改变检测细胞对ATRA的敏感性：利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)曲古抑菌素A (Trichostatin A, TSA)处理NB4-R1细胞,vestern blot检测C/EBPα蛋白表达,并进行流式检测研究TSA与ATRA协同诱导NB4-R1分化作用,MTT比色法检测抑制细胞增殖的作用。结果在ATRA耐药的NB4-R1细胞中C/EBPα蛋白的表达水平明显低于NB4细胞,尤其以42KDa形式蛋白减低最为显著；PI3K/Akt/mTOR通路在NB4-R1细胞中活化减低,而翻译相关因子eIF2α在NB4-R1细胞中活化增高；通过PI3K抑制剂LY294002或mTOR抑制剂RAD001抑制NB4细胞中PI3K/Akt/mTOR通路时,C/EBPα蛋白表达随之降低；NB4-R1细胞中恢复42KDa C/EBPα蛋白表达可诱导粒单核细胞分化抗原CD11b及CD14表达,促进粒单核分化相关基因GM-CSFR的转录,并通过抑制PU.1基因的转录在粒单核分化选择时促进粒细胞的分化。NB4-R1中过表达42KDa C/EBPα蛋白还抑制了AML细胞增殖相关基因FLT3的转录。恢复NB4-R1细胞42KDa C/EBPα蛋白表达增强了细胞对ATRA诱导的细胞分化的敏感性,在1μM ATRA处理下CD11b的表达即有明显提升,细胞出现了终末分化的形态学改变；在NB4-R1细胞中过表达30KDa C/EBPα蛋白则不能诱导细胞分化,也不能恢复NB4-R1细胞对ATRA的敏感性；TSA处理NB4-R1细胞上调C/EBPa蛋白的表达,并与ATRA协同作用诱导细胞分化及抑制细胞增殖。结论PI3K/Akt/mTOR通路抑制及eIF2α过度激活导致NB4-R1细胞中C/EBPα蛋白表达异常,恢复NB4-R1细胞中42KDa C/EBPα蛋白表达可诱导细胞分化并恢复细胞对ATRA敏感性,恢复30KDa C/EBPα蛋白表达则不能恢复NB4-R1细胞的分化和ATRA的敏感性；利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA上调C/EBPα蛋白表达可与ATRA协同作用诱导APL耐药细胞分化及抑制细胞增殖。第2章CEBPA基因突变在AML细胞逃逸NKG2D介导的免疫杀伤中的作用研究背景自然杀伤细胞(nature killing cells, NK)的非特异性免疫杀伤作用在抗白血病免疫监视中占有重要地位,其中NK细胞表面的NKG2D受体对白血病细胞表面的配体的识别是NK细胞发挥杀伤功能的前题。白血病细胞中常见NKG2D配体表达的减低或缺失,使白血病细胞逃逸NK细胞的免疫杀伤作用,成为白血病发病急复发的来源。因此研究白血病细胞NKG2D配体表达的调节机制是增强抗白血病免疫首要解决的问题。转录因子CCAAT增强子结合蛋白alpha (CCAAT enhancer binding protein alpha,C/EBPa)的编码基因CEBPA突变是导致白血病发病及复发的重要原因,我们通过转录组芯片分析发现CEBPA基因及其突变体对NKG2D配体UL-16结合蛋白(UL-16 binding proteins, ULBPs)的表达有不同的调节作用,是增强抗白血病免疫的潜在靶点。目的本部分旨在研究转录因子C/EBPα对NKG2D配体ULBPs表达的调节作用,及其编码基因CEBPA突变对NK细胞杀伤作用的敏感性的影响,揭示CEBPA基因突变在白血病细胞逃逸NKG2D介导的免疫监视中的作用,并为抗白血病免疫治疗和复发的预防提供理论基础。方法通过慢病毒感染不同类型细胞株,建立稳定表达C/EBPα蛋白野生型、三种不同类型突变体及截短的30KDa蛋白(P30)的细胞亚株。突变体分别为：N’端第一个转录激活结构域(transcription activation domain, TAD 1)编码区移码突变(247dupC);N’端TAD2编码区重复突变(584-589dup)；C’端碱性亮氨酸拉链结构域(basic leucine zipper motif, bZIP)重复突变(914-916dup)。通过流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测过表达C/EBPα野生型及不同类型突变体的AML细胞NKG2D配体的表达水平；过表达C/EBPα野生型及不同类型突变体的AML细胞与NK92MI细胞共培养,PI/CFSE双染法检测各亚株对NK细胞杀伤作用的敏感性,CD107a及CD56标记检测NK细胞脱颗粒水平；根据NCBI数据库序列信息利用Promoter Scan工具及SABiosciences database预测C/EBPα与ULBP1基因启动子区域的结合位点。结果不同类型的AML细胞株ULBPs的表达水平不同,使得各细胞株对K92MI细胞杀伤作用的敏感性有显著差异；C/EBPα蛋白野生型在各类型ULBPs均不表达的NB4细胞中上调ULBPs的表达水平,增加NB4细胞对NK细胞杀伤的敏感性,但对主要组织相容性复合物I类分子相关抗原A、B (Major histocompatibility complex class I-related chain A/B, MICA/B)及HLA-I类分子的表达水平无影响；C/EBPα蛋白TAD2结构域突变(NM2)保留了野生型蛋白对ULBPs的调节作用,过表达后仍可以增加NB4细胞对NK杀伤的敏感性；C/EBPα N’端TAD1结构域突变体(NMl)、C’端bZIP结构域突变体(CM)及P30失去上调ULBPs表达的功能,不能增加NB4细胞对NK92MI细胞的杀伤敏感性；颗粒酶途径参与了NK92MI细胞对过表达C/EBPα蛋白的NB4细胞的杀伤作用,与过表达C/EBPα蛋白野生型及NM2突变的白血病细胞共培养的NK92MI细胞脱颗粒水平明显增加；在内源性ULBP2/5/6表达较高的K562细胞中,C/EBPαNM1突变体、CM突变体及P30蛋白竞争性抑制野生型C/EBPα蛋白的功能,下调K562细胞中内源性ULBP2/5/6表达水平,并降低K562细胞对NK杀伤作用的敏感性。结论C/EBPα作为转录因子调节AML细胞中ULBPs的表达,促进NK细胞对白血病细胞的识别与杀伤。TAD1及bZIP结构域的完整性对C/EBPα调节ULBPs功能的行使至关重要。无TAD1结构域的C/EBPaP30蛋白、NM1及CM突变体均失去了对ULBPs转录的调节作用,并竞争性抑制野生型C/EBPα的功能,使AML细胞内源性ULBPs表达降低而逃逸NKG2D配体介导的免疫杀伤作用。