下丘脑是调节能量稳态、食欲和生殖的重要中枢,摄食行为是通过位于下丘脑内的神经环路调控的,其内存在着复杂的食欲调节网络。神经肽Y(NPY)是中枢神经系统中一种非常重要的参与食欲调控的肽。其神经元在脑内分布广泛,在下丘脑内主要分布在弓状核区域,并形成相互投射的神经环路。本研究采用PCR-SSCP及测序方法研究了四个品种黄牛群体共338个个体(其中秦川牛68头、南阳牛100头、郏县红牛130头、晋南牛40头)HCRTR1基因和NPY基因的单核苷酸多态性,分析了基因多态位点与牛部分经济性状的相关性。此外,对秦川牛NPY和HCRTR1基因进行了克隆、表达研究,得到如下结果:1 HCRTR1基因在我国4个牛群体中的遗传多样性本研究采用PCR-SSCP和测序方法首次分析了HCRTR1基因编码区全长在我国4个牛群体中的遗传多态性。在该区域共检测到11个SNP位点,其中4个SNP位点的碱基突变导致了氨基酸的改变,在322 bp处G>A的突变造成缬氨酸变成亮氨酸,481 bp处T>A突变造成色氨酸变成精氨酸,631 bp处C>T突变造成精氨酸变成色氨酸,736 bp处C>T突变造成精氨酸变成色氨酸。其余8处的碱基替换在氨基酸水平上均为同义突变。本研究对牛HCRTR1基因11个SNP位点所在4个牛群体进行Hardy-Weinberg平衡检验,结果发现只有部分SNP位点处于平衡状态。2 HCRTR1基因多态位点与牛生长发育性状的关系利用最小二乘拟合线性模型,对HCRTR1基因多态位点与牛部分经济性状进行显著性检验,结果表明,HCRTR1基因第2外显子位点不同基因型与秦川牛、南阳牛体重和体尺性状间最小二乘均值差异均不显著。对于郏县红牛而言,B、C和D型牛体斜长和管围显著长于A型牛(P<0.05);对于胸围和尻长,D型牛显著大于A型(P<0.05);在郏县红牛1～3岁和4～8岁时,B和D型牛的体高和体重显著高于A型牛(P<0.05)。相同时间内,D型牛体格的绝对生长发育最快,而A型牛最慢,主要表现在体高、体斜长、胸围、管围、尻长和体重性状上。384、420和423 bp处SNP位点多态信息含量为0.2778,郏县红牛的选育过程中适合作为分子标记用于辅助选择。3 NPY基因在我国4个牛群体中遗传多样性本研究利用PCR-SSCP与测序方法首次分析了NPY基因编码区全长及编码区侧翼序列在我国4个牛群体中的遗传多态性。检测到5个SNP位点,其中位于NPY基因第2外显子29 bp处C>A突变引起了氨基酸的改变,由苏氨酸突变为天冬酰氨。第1外显子的78 bp处C>G突变在氨基酸水平上为同义突变,另外3处的突变发生在非编码区。NPY基因5个SNP位点所在4个牛群体Hardy-Weinberg平衡检验结果表明,大部分SNP位点处于非平衡状态。多态信息含量分析结果表明,除秦川牛NPY基因3’端71 bp和南阳牛第2内含子1 725 bp为低度多态座位外,其它位点均为中度多态,适合作为分子标记。4 NPY基因多态性与牛生长发育性状的关系利用最小二乘拟合线性模型,对NPY基因多态位点不同基因型与牛部分经济性状进行显著性检验,结果表明,在NPY基因第3外显子及侧翼序列位点检测到4种基因型,在南阳牛6、12和18月龄时,A型牛体斜长、胸围均显著大于B型牛(P<0.05),发育到24月龄时,A型牛这两项体尺指标仍然大于B型牛,尽管没有达到显著水平。NPY基因3’端71 bp处的SNP位点多态信息含量为0.3457,适合作为选育体格较大的南阳牛一个分子标记。5秦川牛NPY和HCRTR1基因的克隆、表达本试验利用Overlap-PCR技术在国内首次扩增获得秦川牛NPY和HCRTR1基因全长CDS序列。NPY基因编码区全长为294 bp,与GenBank公布序列的同源性为100%。HCRTR1基因CDS序列全长为1 278 bp,编码425个氨基酸,与GenBank中海福特牛该基因的序列比对发现存在4处突变,分别为237 bp:G>C;273 bp:T>C;276 bp:C>T和480 bp:T>C。这4处突变均为同义突变。将NPY和HCRTR1两个基因分别克隆至pET32a+原核表达载体,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导融合蛋白表达。经Western-blot检测证实了NPY蛋白的表达。电泳检测分析发现NPY基因在大肠杆菌中高效表达,表达蛋白以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在。该融合蛋白的分子量约为30 kD,与预测的NPY融合蛋白大小相吻合。而HCRTR1基因在大肠杆菌中没有表达。利用his trap亲和层析柱纯化NPY融合蛋白后,用纯化的蛋白免疫家兔获得抗血清,ELISA检测表明该血清具有很高的特异性和效价,表明NPY融合蛋白具有很好的抗体免疫原性。以获得的抗血清作为一抗,免疫组织化学分析结果表明,牛NPY蛋白在下丘脑弓状核神经细胞的细胞膜和细胞质表达。