生产成本高是燃料乙醇生产面临的主要问题。由于能耗成本大约占燃料乙醇总生产成本的30%,仅次于原料成本,降低能耗成为燃料乙醇产业的重要需求。超高浓度发酵可以提高发酵终点的乙醇浓度,减少精馏操作的能耗及废槽液量,进而节省废糟液处理的能耗,是燃料乙醇创新技术发展的主要方向。由于高浓度乙醇对酵母细胞的强毒性作用,超高浓度乙醇会出现发酵速率慢,糖发酵不彻底的现象,不仅发酵罐设备生产强度显著降低,而且浪费原料。因此,开展酵母细胞乙醇耐性机理的研究,开发相应的调控策略,对燃料乙醇生产实现超高浓度发酵具有重要的理论和实际意义。本文以自絮凝酵母SPSC01为研究对象,使用合成培养基,研究了必需营养源(NH4)2SO4、K2HPO4和维生素及六种重要的二价金属离子(MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、FeSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O和MnCl2·4H2O)对酵母细胞生长、乙醇耐性和发酵终点乙醇浓度的影响。实验结果表明：添加三种营养源对细胞生长和乙醇耐性提高有促进作用；Mg2+、Ca2+和Zn2+能提高酵母细胞的乙醇耐性和发酵终点乙醇浓度,但Mn2+、Fe2+和C02+对酵母细胞乙醇耐性没有明显影响,Co2+对提高发酵终点乙醇浓度有促进作用,Mn2+对乙醇浓度没有明显影响,Fe2+则降低发酵终点乙醇浓度。在此基础上,利用均匀设计法对与乙醇耐性和发酵终点乙醇浓度相关的七个因素进行优化,得到了用于预测酵母细胞乙醇耐性和发酵终点乙醇浓度的回归方程,对以乙醇冲击条件下酵母细胞存活率表示的最大乙醇耐性和发酵终点最高乙醇浓度进行了预测,结果分别为(91.1±1.74)%和47.90±0.95 g l-1,与实验值(90.2±0.89)%和47.15±0.85 g l-1吻合良好,比单因素优化获得的最大乙醇耐受性83.5%和发酵终点最高乙醇浓度43.70 g l-1相比有明显提高,表明这些因素之间存在协同效应,这些研究结果为提高发酵系统酵母细胞乙醇耐性和发酵终点乙醇浓度奠定了基础。在研究工作中首次发现了锌离子对提高酵母细胞乙醇耐性的促进作用,因此进一步考察了分别添加0.01、0.05和0.1g l-1硫酸锌对高浓度(培养基葡萄糖浓度245 g l-1)乙醇连续发酵的影响。实验结果表明：锌的添加能改变自絮凝酵母颗粒的平均粒度,提高其对乙醇和高温胁迫的耐性,使连续发酵终点乙醇浓度相应提高,因此调控培养基中的锌离子浓度,是提高絮凝酵母乙醇耐性的新途径；进一步的研究工作揭示,酵母胞内锌的积累能提高其麦角固醇和海藻糖的含量,这两种物质对提高酵母细胞乙醇耐性有重要的作用,和未添加锌离子的对照组相比,添加0.05 g l-1硫酸锌可以使发酵终点乙醇浓度提高8.4%,甘油浓度下降42.0%,抗乙醇和高温胁迫的耐性分别提高了20%左右。由于锌离子添加和自絮凝酵母粒度分布都影响其乙醇耐性,为了进一步揭示这一现象的机理,研究了培养基中添加0.05 g l-1锌离子和改变自絮凝酵母粒度分布对酵母细胞的保护作用及代谢通量的变化。为了区分这两个因素的影响,锌离子添加组颗粒大小调节为300μm,并与未添加锌离子的同一尺度自絮凝酵母乙醇发酵实验组进行比较。研究结果显示,与自絮凝酵母平均粒径为100和200μm的实验组相比,平均粒径为300μm的实验组乙醇浓度、酵母细胞存活率和糖吸收速率都达到最大,分别为110.0 g l-1、58.0%和286.69C-mmol l-1 h-1,而发酵副产物甘油、琥珀酸、乙酸和丙酮酸浓度分别降低了15.7%、24.5%、48.4%和50.0%。添加0.05g l-1硫酸锌使细胞内总麦角固醇和海藻糖含量分别增加了71.6%和96.5%,在发酵液中未检测到丙酮酸,甘油浓度降低了37.6%,乙醇浓度提高了9.1%,酵母细胞存活率提高了31.0%,葡萄糖代谢、麦角固醇、海藻糖和乙醇节点的碳流通量分别提高了5.3%、28.6%、43.3%和9.1%。此外,自絮凝酵母颗粒平均粒径的增加能增强反应器对细胞的截留作用,提高发酵罐内的生物量浓度,进而增加酵母颗粒群体对葡萄糖的表观吸收能力,使酵解途径碳流量增大,最终导致乙醇浓度的增加。锌离子添加和自絮凝酵母颗粒尺度增大导致乙醇浓度的增加,使胞内大分子生物合成如DNA、RNA、蛋白质和磷脂等节点的碳流量受到明显的抑制,用于维持代谢的ATP能耗增加,体现了高浓度乙醇产生的高负荷以及对细胞生长和发酵的强抑制作用。在超高浓度连续乙醇发酵过程中,酵母颗粒群体对葡萄糖的吸收速率仅为常规乙醇发酵条件下的1/2-1/3,因此提高超高浓度乙醇发酵中酵母细胞对碳底物的吸收能力是提高发酵终点乙醇浓度的关键。