论文部分内容阅读
目的:缺血再灌注损伤[ischemia reperfusion(IR)injury,IRI]是发生在肝脏移植、肝部分切除等肝脏手术中比较常见的组织器官损伤之一,直接影响患者的预后和术后生存率。肝移植领域一直致力于探索更好的减轻肝脏IRI发生的方法和机制。本研究旨在研究小鼠肝脏IRI过程中,IRF-1表达与肝细胞自噬水平的变化,探究IRF-1对IR诱导肝细胞自噬与损伤的影响,揭示肝脏IRI过程中的潜在机制。方法:建立小鼠70%肝脏IRI模型,而后在再灌注后2 h、6 h、12 h、24 h四个不同的时间点,检测小鼠血清中的ALT含量,H&E染色法及TUNEL染色法检测肝组织的病理损伤和凋亡情况,RT-PCR检测肝脏中IRF-1 m RNA的表达,蛋白印迹法检测肝脏IRF-1和自噬标记蛋白LC3II、P62表达,透射电子显微镜(TEM)观察肝细胞中的自噬体形成。通过小鼠尾静脉注射Ad IRF-1腺病毒使小鼠肝组织高表达IRF-1,利用基因敲除技术抑制小鼠肝脏IRF-1表达,建立小鼠70%肝脏IRI模型,检测小鼠血清中的ALT含量,H&E染色及TUNEL染色法分别检测肝组织的损伤情况和细胞凋亡率,蛋白印迹法检测肝脏p-P38、LC3II、P62蛋白的表达,TEM观察肝细胞中的自噬体形成,以进一步验证IRF-1在IR诱导肝组织发生病理性损伤与自噬中所发挥的作用。利用Ad IRF-1或IRF-1si RNA转染AML12细胞,建立细胞缺氧/复氧(模拟肝脏IRI)模型,激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内自噬体变化,蛋白印迹法检测细胞p-P38、LC3II、P62蛋白表达,明确IRF-1在调节缺氧/复氧诱导细胞自噬中所发挥的作用。用Ad IRF-1转染AML12细胞,同时使用SB203580抑制P38蛋白的磷酸化,建立缺氧/复氧损伤细胞模型。TEM观察AML12细胞中自噬体的变化,蛋白印迹法检测细胞LC3II、P62蛋白的表达水平,探究IRF-1调控P38信号通路对缺氧/复氧诱导肝细胞自噬的影响。结果:IR处理各组小鼠血清中的ALT含量较Sham组相比较明显升高(P<0.05),并于再灌注后12 h达高峰;肝组织部分区域细胞内可见大量空泡,肝窦区狭窄、淤血和坏死,肝细胞凋亡率增加。IR处理后小鼠肝组织IRF-1 m RNA和蛋白表达水平较Sham组升高,于再灌注后12 h达高峰,且持续至再灌注后24 h仍未恢复正常水平。IR处理后小鼠肝组织自噬标记蛋白LC3II、P62表达水平升高,分别于再灌注后6 h、12 h达高峰;再灌注后12 h肝细胞内自噬体明显多于Sham组(P<0.001)。与Ad GFP组相比,Ad IRF-1组再灌注12 h小鼠血清ALT水平明显升高(P<0.001),且肝窦狭窄和肝细胞坏死等病理损伤加重,肝细胞凋亡率亦明显升高(P<0.001);同时p-P38、LC3II、P62蛋白表达水平和自噬体数量明显增加。与野生型(WT)小鼠相比,IRF-1基因敲除(KO)小鼠经IR处理后,血清ALT水平和肝组织病理损伤程度下降(P<0.01),肝细胞凋亡率降低(P<0.01),肝组织p-P38、LC3II、P62蛋白表达量和自噬体数量明显减少。GFP-IRF-1组AML12细胞中p-P38、LC3II、P62蛋白表达水平和自噬体数量较GFP-NC组明显升高。反之,与si RNA-NC组比较,si RNA-IRF-1组AML12细胞中p-P38、LC3II、P62蛋白和自噬体数量明显减少。此外,与GFP-IRF-1组相比较,SB203580抑制P38蛋白磷酸化后,GFP-IRF-1+SB203580组AML12细胞中自噬标记蛋白LC3II、P62表达水平降低,肝细胞内自噬体数量亦明显减少(P<0.001)。结论:IR诱导小鼠肝组织IRF-1表达上调和自噬水平增加。IRF-1能够增强IR诱导的自噬通路的激活,加重小鼠肝脏IRI;抑制IRF-1表达能够抑制IR过程中自噬通路的激活,减轻小鼠肝脏IRI,其机制可能与IRF-1激活P38蛋白磷酸化,进而过度激活肝细胞自噬通路,加重肝细胞损伤有关。