【摘 要】
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咖啡因是一种嘌呤类生物碱,其在土壤中难以降解,且对动植物均有不同程度的危害,因此咖啡因降解成为国内外的研究热点。由于传统咖啡因降解方法存在各种各样的弊端,国内外学者提出一种新型环保的生物降解法降解咖啡因,包括微生物降解及酶学降解等。随着对咖啡因降解菌株的深入研究,其降解途径及机理的解析日趋完善,而咖啡因降解酶类的研究却相对滞后。本文旨在分离纯化出Paraburkholderia caffeinil
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咖啡因是一种嘌呤类生物碱,其在土壤中难以降解,且对动植物均有不同程度的危害,因此咖啡因降解成为国内外的研究热点。由于传统咖啡因降解方法存在各种各样的弊端,国内外学者提出一种新型环保的生物降解法降解咖啡因,包括微生物降解及酶学降解等。随着对咖啡因降解菌株的深入研究,其降解途径及机理的解析日趋完善,而咖啡因降解酶类的研究却相对滞后。本文旨在分离纯化出Paraburkholderia caffeinilytica CF1菌株中参与咖啡因降解关键酶,并探究其酶学特性,以期为今后脱甲基酶的定向分子改造及固定化奠定基础。课题组前期分离得到高效咖啡因降解菌P.caffeinilytica CF1可以利用咖啡因作为唯一碳、氮及能源生长。经预测,CF1菌株中参与咖啡因降解的N1-脱甲基酶（Cdn A）、N3-脱甲基酶（Cdn B）及N7-脱甲基酶（Cdn C）分别与Rieske型氧化还原酶（Cdn D）构成氧化还原体系,共同行使咖啡因脱甲基功能,其中Cdn D负责氧化还原过程中将NADH的电子传递给Cdn A、Cdn B及Cdn C。本研究在前期实验的基础上,通过密码子优化、更换表达载体及宿主等手段,异源表达酶活力高、稳定性强的Cdn A和Cdn D;利用镍离子亲和层析技术纯化实验室前期已构建的Cdn B和Cdn C及本实验重新构建的Cdn A和Cdn D,并测定Cdn A、Cdn B、Cdn C及Cdn D的分子质量分别为44、58、47及64 k Da;借助生物信息学手段分析蛋白质保守结构域得到Cdn A及Cdn B为Rieske型加氧酶（Rieske Oxygenase,简称RO）、Cdn C为非血红素铁加氧酶、Cdn D为RO还原酶;并从底物特异性、酶促反应动力学参数、温度、p H及金属离子等方面表征各蛋白的催化特性,其中Cdn A、Cdn B及Cdn C的最适反应条件均为30°C、p H 8.0,稳定p H分别为6.5～8.0、6.5～8.5及6.0～9.0;Cdn D的最适反应条件为25°C、p H 8.0,稳定p H为6.0～10.0。
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