苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)是杆状病毒的代表种,为双链环状DNA病毒。gp41基因是杆状病毒的核心基因之一,其同源基因存在于所有已测序的杆状病毒基因组中。GP41定位于囊膜和核衣壳之间。已知其对BV核衣壳出核是必需的,但其具体作用机制尚不清楚。本研究试图从GP41与宿主蛋白相互作用的角度探究其功能。首先,从AcMNPV基因组克隆gp41基因,将其插入载体质粒pGBKT7构建诱饵质粒pGBKT7-gp41;以pGBKT7-gp41为诱饵,通过酵母双杂交实验从Sf9细胞cDNA文库中筛选与AcMNPV GP41(?)互作用的Sf9细胞蛋白基因,结果从中筛选出了三个阳性克隆。序列分析发现,其中两个克隆包含的cDNA序列的预期编码产物是一种9’的同源物；另一个cDNA克隆的预期编码产物是12的同源物。为了验证GP41与9’和12的相互作用,利用BAC-to-BAC系统分别将gp41基因和9’基因或12基因一起克隆到AcMNPV的polh位点,在Sf9细胞中分别表达GST-GP41、HIS-9’/12融合蛋白。GST-pull down实验结果显示,HIS-9’随同GST-GP41融合蛋白一起吸附于GST亲和树脂上,进一步证实Sf99’蛋白与AcMNPV GP41之间的相互作用。分别构建表达GP41-EGFP和9’/12-RFP融合蛋白的重组病毒；用其感染Sf9细胞,分别在感染后不用时间点观察GP41与9’/12细胞内定位。18hpi, GP41-EGFP在整个细胞中都有分布；24hpi和36hpi,这种融合蛋白逐步向核内聚集；48hpi,绝大部分聚集在核内。9’-RFP在各个时间点均只见于细胞质中；12-RFP则定位在核膜周围。在GP41-EGFP和12-RFP同时表达的情况下,48hpi,还有一部分GP41-EGFP定位在核膜周围。此时,GP41-EGFP与12-RFP在核膜周围存在明显的共定位现象。根据这一结果推测,GP41与12的相互作用可能影响GP41的入核。为了识别GP41与9’和12之间的相互作用位点,构建了16个gp41基因截短突变体,将截短突变体分别克隆至诱饵载体pGBKT7构建表达截短型GP41的诱饵质粒。分别用这些诱饵质粒与9’和12cDNA克隆进行回交实验,结果,初步确定GP41与9’的相互作用位点位于161-210AA之间,GP41与12的相互作用位点位于81-330AA之间。利用X-Red同源重组技术,用氯霉素抗性基因(cat)替代AcMNPV bacmid bMON14272中66326nt-66825nt (gp41)的500bp序列,成功构建了gp41缺失型bacmid vAcgp4IKO。利用BAC-to-BAC系统将egfp和AcMNPV多角体蛋白基因(polh)分别插入vAcgp41KO和bMON14272的polh位点,构成带有egfp和polh标记的gp41敲除突变体vAcgp41KO-PH-Pp10-egfp和野生型bacmid vAcPH-Pp10-egfp。通过转染-感染实验证实gp41是BV产生所必需的。敲除gp41导致BV粒子无法产生,但不影响多角体的形成。