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人源甲状腺过氧化物酶(Human thyroid peroxidase,hTPO)是甲状腺细胞合成甲状腺激素的关键酶,可用于检测自身免疫性甲状腺疾病病人血清中的抗体。因此,表达和生产具有免疫反应活性的重组hTPO对于自身免疫性甲状腺疾病诊断产品的开发具有重要的意义。众所周知,杆状病毒系统在表达生产人源活性蛋白方面具有非常突出的优势,目前已经被广泛应用于多种疾病相关抗原蛋白的表达生产中。hTPO也已经在杆状病毒表达系统实现了表达,但存在的主要问题是:仅有少量蛋白通过分泌途径转运到了细胞培养上清中,而绝大部分重组蛋白聚集在细胞裂解沉淀组分中,大大增加了蛋白纯化的复杂性。本课题中,我们建立了一套在昆虫细胞系统中提高截短形式hTPO(hTPOt)分泌表达的流程,并在Wave-like反应器中实现了放大培养。具体工作内容包括:(1)首先,我们构建了 5种信号肽来替代原有蛋白N端的原始信号肽,并筛选到了肽酰甘氨酸α酰胺化单加氧酶PAM,即SPPAM为有效的分泌信号肽,它在协助hTPOt蛋白于High 5细胞的分泌表达中显示出了重要作用。(2)其次,为实现融合了 SPPAM的hTPOt(p-hTPOt)规模生产,我们尝试在Wave-like反应器中表达,通过正交实验来优化4个参数,包括转速,转角,细胞接种密度和血清添加量,并得到了最优表达条件。基于优化后的表达条件,我们在5L反应器上进行了规模扩大,并将收获的细胞培养基上清通过固定化金属亲和层析(IMAC)和离子交换层析进行蛋白纯化,获得了>95%的蛋白纯度。(3)最后,将本实验中表达并纯化的p-hTPOt蛋白与人血清样本进行ELISA双抗原夹心法实验,检测发现纯品p-hTPOt具有较高灵敏性和特异性(80%和100%)。综上,本课题建立了一套在杆状病毒表达系统中提高hTPOt蛋白分泌表达的流程,并在Wave-like反应器中实现了简易放大,最终得到了具有高灵敏度及特异性的目的蛋白,为将来开发自身免疫疾病诊断检测相关产品提供了廉价、高效的抗原原料。