双酶水解蚕蛹蛋白制备多肽的研究

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中国是着名丝绸古国,“丝绸之路”闻名与此,自古以来蚕桑业在中国的农业中都是重要的部分,远在七千多年前我国就有养蚕抽丝的记载。目前,世界80%的产丝量都是由我国产出。蚕蛹蛋白是一种优质蛋白资源,蛋白质的含量在干蚕蛹中高达50%左右,富含丰富的氨基酸,其含量高可达60%,囊括了18种氨基酸,其中8种人体必需氨基酸含量是氨基酸总量40%左右,其中8种必需氨基酸占到总量45%左右,而必需氨基酸和非必需氨基酸是合理的,平衡的,0.73的质量比,符合世界卫生组织/联合国粮食及农业组织(WHO/FAO)提出的参考蛋白模式,营养价值较高。在本文中,蚕蛹为原料,主要从以下几个方面对蚕蛹蛋白水解、后处理进行了研究,研究结果如下:一、采用索氏提取法提取蚕蛹中的油脂类,制备蛋白含量较高的脱脂蚕蛹,选取了4种有机溶剂进行浸取,结果表明最佳提取剂为石油醚,提取的料液比为1:6,脱脂时间为4.5h最为适宜,其出油率较高,达到27.8%,得到的蚕蛹蛋白含量高且蛹油品质较好。选取Alcalase(碱性蛋白酶)、Flavourzyme(风味蛋白酶)、Proteinase(中性蛋白酶)和Papain(木瓜蛋白酶)四种蛋白酶对脱脂后的干蚕蛹粉进行酶解制备低分子多肽,通过测定蛋白酶酶解液的水解度和寡肽得率作为指标,及工业化生产等综合考虑,结果表明Alcalase (碱性蛋白酶)和Proteinase(中性蛋白酶)对蚕蛹蛋白具有较好的水解效果。以水解时间、水解pH值、水解温度、底物浓度和蛋白酶添加量五个实验因素进行蚕蛹蛋白水解制备多肽的研究,以蚕蛹蛋白的水解度作为参考,得出单酶水解的最佳条件为:中性蛋白酶水解蚕蛹蛋白在pH=7时,酶解时间5h、酶解温度55℃、底物浓度6%、加酶量3.5%为最佳的水解条件;水解液pH=8.5时,添加3%碱性蛋白酶水解底物浓度为6%,水解5小时效果最好。并改变两种蛋白酶酶质量比共同酶解蚕蛹蛋白,当碱性/中性蛋白酶两者酶质量比为3:1比较适宜。二、对双酶法(即碱性蛋白酶与中性蛋白酶)水解蚕蛹蛋白的工艺条件进行了探究。在上述实验的基础上,选取了水解时间、水解温度、底物浓度以及蛋白酶添加量等四个主要因素,通过通过响应面分析试验分析对蛋白酶水解度的影响,最终优化得到碱性蛋白酶与中性蛋白酶协同作用下水解蚕蛹蛋白最佳的工艺条件。结果表明,蛋白酶解pH为8.5、酶解温度55.0℃、底物质量浓度为6.0%、水解酶添加量为3.4%水解酶用量及时间分配中,由上述单因素实验可知碱性蛋白酶比例较高时水解度较高,且两者酶质量比为3:1比较适宜,故时间比例也为3:1)水解4.5h,在此工艺条件下蛹蛋白酶解,得到的水解度高达25.75%。通过SDS (十二十二烷基硫酸钠)—PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳)对蛋白质分子量的测定,与标准蛋白marker的比对,酶解液所跑的电泳条带基本上看不出来,这说明经蛋白酶酶解后溶液中原有蛋白分子都被分解成小分子肽,而且分子量小于标准蛋白marker的最小分子量。三、对不同性质的吸附剂进行对比实验,最终发现活性炭作为吸附剂对蚕蛹蛋白酶解液的颜色深的处理效果较好。以水解液脱色率和氨基酸损失率为考察指标对活性炭用量、脱色时间、脱色温度、水解液pH值4个因素进行探究,对脱色条件使用L(934)进行了优化与正交设计,最佳脱色条件为:活性炭用量为4%、水解液的pH值取4.0、脱色时间为20min、脱色温度为60℃。在优化的实验条件下,蛹蛋白质水解速率的脱色达到93.29%,其中氨基酸是只有23.12%的损失率。利用阴阳离子交换树脂可以有效除去水解物中的大部分盐分,脱盐率达91.20%以上,且样品中氮的损失率仅为6.3%。精制后的蚕蛹蛋白水解液进行调配处理,得到一款风味独特、口感适宜的蚕蛹氨基酸饮料。以精制酶解液为基础,添加4%茉莉花浸提液、蔗糖的浓度为7%和柠檬酸的添加量为0.1%进行调配口感最适宜。茉莉香蚕蛹多肽氨基酸饮料口感柔和,酸甜适宜,营养价值高,含氨基酸为13.86g/L,其中人体必需氨基酸总量为6.86g/L,占到茉莉香蚕蛹多肽氨基酸饮料的49.48%,与FAO/WHO(联合国粮农组织/世界卫生组织)的相符合。
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