类胡萝卜素是一类在自然界中普遍存在并且在微生物,植物,动物中具有重要功能的四萜烯有机分子化学色素。微生物,植物可以利用类异戊二烯为原料生产类胡萝卜素。类胡萝卜素特殊的不饱和结构赋予了它特别的功能。在植物与蓝细菌中,β-胡萝卜素参与了光合作用的能量传递过程。在高等动物中,类胡萝卜素是一种类高效的自由基猝灭剂。在细菌中,类胡萝卜素参与细菌对外界环境的抵抗。人类与类胡萝卜素更是密切相关,β-胡萝卜素是维生素A的前体,参与人体多种必需的反应,缺乏维生素A会导致夜盲症。类胡萝卜素的功能主要表现它能猝灭氧自由基,抗氧化,增强人体免疫力,预防心血管疾病,抗癌等多种功能。在此背景下,生产类胡萝卜素的工业前景变得光明。生物发酵的方式安全,天然,是最健康可行的生产类胡萝卜素的方式,适合大规模的生产。利用基因工程手段生产类胡萝卜素的前景愈发明亮。红球菌作为放线菌的一种,与人类关系密切,在医药工业上有重要意义:红球菌能够产生各种酶制剂,维生素,有机酸;具有天然的去污能力。近期研究表明,绝大多数的红球菌都产生类胡萝卜素,这使得体外异源表达红球菌产类胡萝卜素基因生产类胡萝卜素成为可能。本实验的初期,通过对北冰洋海水采集的样品进行细菌的分离鉴定,发现一株产类胡萝卜素的红球菌B7740。通过一系列初级的鉴定,确定其能够大量生产类胡萝卜素。以此为基础,表达红球菌B7740中的类胡萝卜素代谢基因,探究其产类胡萝卜素代谢通路,构建产类胡萝卜素工程菌的构想得以实施:1本实验对红球菌B7740进行了全基因组测序并对其基因加以注释。结果表明,红球菌B7740全基因组大小为5,341,557bp,GC含量为64.93%。基因组序列包含5196个预测的编码序列(CDS),47个tRNA、4个5S rRNA、4个LSU rRNA、4个SSU rRNA。全基因组包含和424个代谢系统(subsystems)。红球菌菌b7740的全基因组序列已经提交到GenBank数据库,基因登录号为CP010797。2红球菌B7740含有产类胡萝卜素关键基因:八氢番茄红素合成酶基因(Crt B),牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(Crt E),八氢番茄红素脱氢酶基因(Crt I),这些基因介导番茄红素的产生。这些基因在GenBank中的序列号为:gb|CP010797.1|。3本实验选取PET30a为载体框架,利用重叠PCR,酶切连接后扩增全长等理论手段构建了PET30a-EBI载体,完成了Crt E,Crt B,Crt I三个基因的共表达。结果表明简单的在大肠杆菌中共表达Crt E,Crt B,Crt I三个基因并不能使其产生番茄红素。4为了进一步探究红球菌产类胡萝卜素代谢通路,本实验从东太平洋海水样品中分离得到的细菌样品中选取了4株颜色有明显差异的红球菌,对其基本特征进行了鉴定,产类胡萝卜素种类进行了初探。随后本实验对此4株红球菌进行了基因组草图的测定。注释后的基因组提交到Genbank数据库,基因组BioProject登录号为PRJNA314738,版本为XXXX01000000。通过对其基因组分析注释,找到了4株红球菌产类胡萝卜素的关键基因。将此4株红球菌产类胡萝卜素基因与红球菌B7740进行对比,参照其产色素的类型,发现Rhodococcus sp.EPR-147,Rhodococcus sp.EPR-279,Rhodococcus sp.B7740三株菌种的Crt E,Crt B,Crt I基因相对保守,蛋白序列同源性高,其菌落颜色较深,色素产量较高。相比之下,Rhodococcus sp.EPR-134中Crt E,Crt B,Crt I基因与其他红球菌比较,基因较开放,且其不能生产类胡萝卜素。Rhodococcus sp.EPR-157介于二者之间,其基因改变情况较小,生产少量类胡萝卜素。由此推断:Crt E,Crt B,Crt I基因仍是红球菌中产类胡萝卜素的关键基因,其突变可能导致类胡萝卜素基因蛋白活性的丢失。