破骨细胞(osteoclast, OC)具有独特的骨吸收活性,其骨吸收与成骨细胞骨形成之间的动态平衡在机体骨重建过程中扮演着重要的角色。破骨细胞数量或功能活性的过度增加会造成多种骨类疾病,如骨质疏松、风湿性关节炎、多发性骨髓瘤、牙周炎等。因此,对破骨细胞分化和骨吸收的研究具有重要的临床意义。在机体生理或者病理条件下,成骨细胞或者基质细胞膜上的细胞核因子-κB受体活化因子配体(recetor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)与破骨细胞前体细胞细胞膜上的细胞核因子-κB受体因子(recetor activator of nuclear factor-κB, RANK)结合,促进破骨细胞分化和成熟。成骨细胞分泌的骨保护素(osteoprotegerin, OPG)是RANKL的诱饵受体,能与RANK竞争RANKL,从而抑制破骨细胞的分化、成熟以及骨吸收活性。细胞骨架是真核细胞胞质中错综复杂的网络结构,在细胞形态和迁移等方面起着至关重要的作用。细胞骨架参与细胞内物质运输、信息传递、能量转换、细胞分化与分裂等活动。研究表明,破骨细胞的骨吸收活性与细胞骨架密切相关。目前关于OPG对破骨细胞骨吸收影响的研究主要集中在OPG能够通过OPG/RANKL/RANK系统抑制破骨细胞的分化从而影响破骨细胞的骨吸收功能。虽然细胞骨架在破骨细胞分化和骨吸收过程中扮演着重要的角色,但是在这个过程中,关于细胞骨架的变化和OPG对细胞骨架的影响仍不清楚。本论文旨在研究破骨细胞分化过程中细胞骨架的变化和Rho GTPases家族的调控作用以及OPG的作用,为揭示OPG抑制破骨细胞分化的分子机理提供科学依据。1.破骨细胞的诱导培养与纯化破骨细胞是终末细胞,不能够分裂增殖,体内含量极少。为了获得大量有活力的破骨细胞(osteoclast, OC),建立了利用RANKL和M-CSF诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞的方法。为了利用RAW264.7细胞获得大量破骨细胞,将RAW264.7细胞接种到6孔板中,密度分别为4×103、8×103和1.6×104个/mL,同时添加利用60 ng/mL RANKL和50 ng/mL M-CSF处理细胞。结果表明,1.6×104个/mL、8×103个/mL和4×103个/mL的细胞密度分别培养2d、3d和4d后,出现大量的单核细胞凋亡并伴随破骨细胞产生。结果表明4×103个/mL接种密度下,破骨细胞产生的数量最多。这说明低接种密度和长时间的诱导有利于破骨细胞的形成。2.破骨细胞分化过程中细胞骨架的变化用RAW264.7细胞诱导破骨细胞,采用RTCA、TRAP染色、免疫荧光染色、QRT-PCR等技术分别检测了破骨细胞分化过程中的细胞形态学和骨架结构,以及Rho GTPases家族、破骨细胞分化和骨吸收相关酶的表达。结果表明,在诱导破骨细胞分化过程中,细胞骨架、细胞形态和相关调节因子的表达均发生了剧烈的变化,根据细胞形态将破骨细胞分化成熟的过程分为4个阶段；(1)由未分化的RAW264.7诱导为破骨细胞前体细胞的过程,即0-1d；(2)破骨细胞前体细胞潜伏期,即1-3d；(3)破骨细胞前体细胞转化为未成熟破骨细胞的过程,即3-4d；(4)破骨细胞成熟过程,即4-6d。在破骨细胞前体细胞中,有三种类型的丝状伪足,在未分化的细胞中仅有一种类型的丝状伪足,而成熟后的破骨细胞则丝状伪足完全消失。相互融合的细胞是具有选择性的,并且融合首先发生于丝状伪足。丝状伪足和伪足小体不仅在细胞的迁移和封闭带的形成过程中起着重要的作用,而且在细胞融合前的相互选择和融合中细胞核与细胞浆的移动方向上扮演着重要的角色。另外,Cdc42v1、 RhoU和RhoF分别调节着三种不同类型丝状伪足的形成,而Rac1、Rac2和FLNA可能与细胞的选择性有关。3.RAW264.7细胞诱导分化为破骨细胞过程中的调控机制在RAW264.7细胞诱导分化为破骨细胞的过程中,用霍夫曼显微镜拍摄技术、免疫荧光染色、DNALadder琼脂糖凝胶电泳以及qRT-PCR等技术研究了细胞的变化及调控机制。结果表明,RANKL和M-CSF诱导RAW264.7细胞,一部分分化为破骨细胞,未分化的细胞几乎全部凋亡；而RANKL和M-CSF处理没有分化能力的肝细胞系BRL-3A时,BRL-3A未发生凋亡。当利用OPG完全抑制破骨细胞的分化后,虽然RAW264.7受到RANKL和M-CSF的作用,但细胞并没有发生凋亡。与凋亡有关的Rho GTPases基因Rac1、RhoA和RhoV检测表明,在破骨细胞分化过程中,伴随着大量单核细胞发生凋亡,RhoV mRNA的表达量也显著上调。与之相反,当利用OPG抑制了因单核细胞分化所引起的凋亡后,RhoV随之明显下调。而Rac1和RhoA表达并没有出现与凋亡现象相对应的变化趋势。表明RAW264.7诱导分化为破骨细胞过程中发生了细胞的凋亡,RhoV在凋亡过程中发挥了重要作用,OPG能够通过抑制破骨细胞的分化过程而阻止细胞凋亡的发生。4.OPG抑制破骨细胞分化过程中丝状伪足变化的调控机理丝状伪足对细胞的迁移和融合起着重要的作用,本试验研究了RAW264.7细胞诱导分化为破骨细胞的过程中,OPG对破骨细胞前体细胞丝状伪足的影响以及调控相关基因表达的影响。结果表明,OPG作用于破骨细胞前体细胞可导致丝状伪足变短、增多,最终影响破骨细胞产生的数量和大小。与调控丝状伪足相关的Cdc42、RhoU、RhoF以及ArhgefB/Net1和DOCK5 mRNA表达均出现了显著性的下调。表明OPG能够通过Rho GTPases信号通路中的Arhgef8/Netl和DOCK5以及Cdc42、RhoU、RhoF的表达,进而影响破骨细胞前体细胞丝状伪足的形态学和数量的变化,最终抑制了破骨细胞的形成。5.OPG抑制破骨细胞骨吸收的机理研究封闭带是破骨细胞特有的细胞骨架结构,封闭带的完整性对破骨细胞的骨吸收起决定性的作用。本研究利用霍夫曼显微镜和激光共聚焦显微镜观察了破骨细胞分化过程中封闭带的形成过程,并利用免疫荧光、霍夫曼显微拍摄、qRT-PCR、Western blot、扫描电镜等技术研究了OPG对已形成的封闭带以及破骨细胞骨吸收活性的影响,以及对封闭带起关键调节作用的相关基因表达的影响,包括Rho GTPases信号通路中的Arhgef8/Net1、DOCK5、 Rho GTPases家族和ROCK。结果表明,RAW264.7诱导分化为破骨细胞过程中第5d形成封闭带,此时破骨细胞边缘凸起成带状、细胞核分散分布、无丝状伪足。形成封闭带后,对照组的封闭带完整；在20 ng/mL OPG处理组中,封闭带出现缺损；在40 ng/mL和80ng/mL OPG处理组中,封闭带已完全消失,并且在整个破骨细胞的底部伪足小体分散或者成簇状的分布。另外,在20 ng/mL OPG处理组中未形成骨吸收陷窝,说明骨吸收活性消失。不同浓度OPG处理后,Rho GEFs中的Arhgef8/Netl和DOCK5、18个Rho GTPases种的10个成员(RhoA、RhoB、Cdc42v1、Cdc42v2、RhoU/Wrch1、RhoF/Rif、Rac2、Rnd1和RhoBTB1)、ROCK的两个成员(ROCK1和ROCK2)的表达量都出现了显著性的下降。表明OPG能够通过抑制Rho GTPases信号通路相关基因的表达,影响伪足小体的分布,从而造成封闭带的损伤或破坏,进而抑制了破骨细胞的骨吸收活性。