研究背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种全身性慢性自身免疫性疾病,主要表现为滑膜侵袭性增生,最终形成血管翳,导致关节软骨及骨质破坏。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)既是RA关节损伤的效应细胞,也参与关节破坏,其功能的改变在RA的疾病进程中起着至关重要的作用。RAFLS的形态学与生物学行为均呈现"类肿瘤样"改变,处于"稳定活化"(stable activation)的状态,除分泌大量的炎症因子、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)、趋化因子外,其迁移、侵袭、异常增殖和抗凋亡能力也异常增强,滑膜炎症持续存在,最终导致血管翳形成,侵蚀破坏关节软骨和骨质,对疾病的预后造成不良影响。益母草碱(leonurine)是从益母草中提取的中药单体,既往研究表明其具有双向调节子宫平滑肌、抑制炎症、调节免疫及抑制肿瘤等多种药理学作用,但对于RA的影响,至今尚未见报道。由于益母草碱对于肿瘤、乳腺炎以及人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)的抑制作用及其涉及的调节机制与炎症及免疫调节密切相关,因此我们推测:益母草碱对RA炎症因子释放及异常生物学行为也具有调控作用。为此,本文拟研究益母草碱对RAFLS活化及异常生物学行为的调控,并进一步探讨其可能机制及作用靶点,最后通过胶原诱导型关节炎(Collagen-induced Arthritis,CIA)小鼠验证其对体内滑膜炎症及关节破坏的影响。一、益母草碱对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的活化、迁移和侵袭的影响目的:1.培养和鉴定RAFLS。2.研究益母草碱对RAFLS活化、增殖、凋亡、迁移和侵袭的调控作用。方法:10例符合美国风湿病学会1987年RA诊断标准的患者,通过关节镜下滑膜切除术取得其滑膜组织,采用胶原酶消化培养法及组织块培养法培养获得原代FLS。采用细胞免疫荧光法对FLS中特异表达的vimentin蛋白进行鉴定。采用MTT法检测益母草碱对RAFLS细胞活力的影响,采用RT-qPCR检测炎症因子、MMPs的mRNA表达,采用CBA法和ELISA法检测炎症因子、MMPs的蛋白表达,采用EDU法检测细胞增殖功能,采用流式细胞术检测细胞的凋亡能力,采用划痕、体外迁移及侵袭实验检测细胞体外迁移和侵袭功能,采用免疫荧光法标记细胞伪足形成。结果:体外分离培养的原代细胞有vimentin高表达,鉴定为RA FLS。MTT实验结果显示:使用5μM、10μM、20μM益母草碱和5μMMTX处理RAFLS24h及48h,与空白组相比,RAFLS的细胞活力无显著改变(P>0.05)。在炎症因子TNF-α(1Ong/ml)刺激条件下,大部分炎症细胞因子和MMPs的表达水平显著升高,但是经过益母草碱和MTX干预后,RAFLS中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α与MMP-1、MMP-3的表达水平相对于TNF-α组显著降低(P<0.05或P<0.01),且呈浓度依赖性,提示益母草碱和MTX可抑制RA FLS的活化。增殖凋亡实验结果显示:益母草碱对RAFLS的增殖和凋亡能力无影响(P>0.05),而MTX可显著降低RAFLS的增殖能力,同时促进细胞凋亡(P<0.01)。在划痕实验中,益母草碱组、MTX组与空白组相比,划痕明显,细胞融合生长不明显。在体外迁移、侵袭实验中,益母草碱组、MTX组与空白组相比,迁移过膜的细胞明显减少(P<0.05或P<0.01)。伪足形成实验显示:益母草碱高剂量组和MTX组伪足形成能力明显弱于空白组(P<0.05),提示益母草碱和MTX能显著抑制RAFLS的迁移及侵袭能力。结论:益母草碱能显著抑制RAFLSIL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α与MMP-1、MMP-3的表达及分泌,同时对RA FLS的迁移和侵袭亦有抑制作用。二、益母草碱抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞活化、迁移和侵袭的分子机制研究目的:研究益母草碱调控RAFLS活化、迁移和侵袭的分子信号机制。方法:取培养至3-5代并经过鉴定的RAFLS进行实验。采用免疫印迹法检测信号通路蛋白NF-κB、IκBα、IKK、p38、JNK、ERK及其磷酸化水平。免疫荧光法检测NF-κB p65入核情况。RT-qPCR法检测信号通路蛋白抑制剂对RAFLS IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α与MMP-1、MMP-3表达的影响。体外迁移或侵袭实验检测信号通路蛋白抑制剂对细胞体外迁移、侵袭功能的影响。结果:益母草碱可下调由TNF-α引起的NF-κB和IκBα的磷酸化水平,并抑制由TNF-α引起的NF-κB p65入核。益母草碱也可显著下调TNF-α引起的p38 MAPK和JNKMAPK的磷酸化水平(P<0.05或P<0.01)。p38MAPK抑制剂SB203580可显著抑制由TNF-α引起的NF-κB和IKBα的磷酸化(P<0.05),而JNKMAPK抑制剂SP600125对NF-κB和IκBα的磷酸化无明显影响(P>0.05)。SB203580、SP600125和NF-κB抑制剂PDTC均可以显著抑制RAFLS分泌IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和MMP-1、MMP-3,并抑制RAFLS的迁移与侵袭能力(P<0.05或P<0.01)。提示益母草碱是通过p38介导的NF-κB信号通路和JNK MAPK信号通路调控RA FLS炎症因子及MMPs的表达和体外迁移、侵袭功能。结论:益母草碱通过p38/IκBα/NF-κB信号通路和JNK MAPK调控RA FLS的活化、迁移及侵袭。三、益母草碱对小鼠胶原诱导性关节炎的治疗作用目的:观察益母草碱对小鼠CIA关节炎模型的治疗作用。方法:SPF级DBA/1雄性小鼠32只,8周龄,除正常组外,其余小鼠予牛Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂的乳化剂造模。将CIA小鼠随机分为三组,分别为模型组、益母草碱组、MTX组。小鼠关节炎发病之日起,给予腹腔注射相应溶剂和药物,连续给药28天。观察小鼠的一般情况、关节炎症状、踝关节肿胀程度等。28天后取踝关节,固定、脱钙、脱水、包埋切片,进行HE染色并观察其病理改变,采用ELISA法检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α表 达量。结果:CIA模型小鼠第一次免疫后11-13天开始发病,踝关节出现红肿,加强免疫后大部分小鼠发病,严重者出现关节活动受限,并随时间推移而逐渐加重。益母草碱组和MTX组踝关节红肿症状及关节炎评分、后肢肿胀体积较模型组明显降低(P<0.05或P<0.01)。组织病理学改变:正常组大鼠踝关节结构完整,未见滑膜增生及炎症细胞浸润。模型组大鼠踝关节处滑膜增生,炎症细胞浸润明显,细胞排列紊乱,并出现软骨和骨的侵蚀破坏。益母草碱组和MTX组滑膜病理改变较轻,滑膜少许增生,炎性细胞浸润明显减少,未出现软骨和骨破坏。与模型组比较,益母草碱组和MTX组病理学评分下降具有统计学差异(P<0.05)。血清炎症因子改变:造模后,模型组较正常组IL-1β、IL-6、TNF-α表达明显上升(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,益母草碱组和MTX组IL-1β、IL-6、TNF-α表达明显降低(P<0.01)。结论:益母草碱能有效控制CIA小鼠关节炎症状,抑制滑膜炎症及关节软骨和骨质破坏。益母草碱对RA的滑膜炎症以及随后的关节破坏均有一定的治疗作用。