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随着全球化石资源的逐渐枯竭和人们对环境问题的日益重视,生物质乙醇成为了最具潜力的化石燃料替代品。大肠杆菌因其具有清晰的研究背景,广泛的底物代谢范围以及成熟的发酵技术,而成为最有可能用于生物质乙醇生产的新一代菌种之一。大肠杆菌对生物质水解液中高浓度单糖和发酵过程中积累的高浓度乙醇的耐受性较差是制约乙醇产率的主要因素。而海藻糖是大肠杆菌遭受环境胁迫时合成并积累的一种最重要的相容性溶质,可以赋予细胞耐受各种压力因素的能力。为此,本论文通过改造大肠杆菌海藻糖代谢途径以增强胞内海藻糖积累,并引入新的乙醇合成途径,以期获得对发酵底物和产物具有高耐受性并且发酵性能良好的新菌种,获得了如下主要研究结果:构建和筛选了海藻糖积累突变株。应用Red同源重组技术删除大肠杆菌B0013-1031H中与海藻糖分解相关的三个基因treA、treF和treC,和过表达海藻糖生物合成操纵子otsBA,成功构建了一系列海藻糖代谢途径突变株:JC11(ΔtreA)、JC12(ΔtreF)、JC13(AtreC)、JC21(ΔtreA,ΔtreF)、JC22(ArreF,ΔtreC)、JC23(ΔtreC,ΔtreA)、JC31(ΔtreA,ΔtreF,ΔtreC)和 JC41(ΔtreA,AtreF,AtreC,PostBA::PldhA)。8 株突变株均达到了胞内海藻糖积累的预期效果,筛选出了在普通培养条件下胞内海藻糖含量较高的突变株JC31和JC41,胞内海藻糖含量分别为8.13和28.6mg/g细胞干重,分别高达出发菌株的3倍和近11倍。研究了菌株耐受性与胞内海藻糖积累的关系。耐受性试验结果表明,胞内海藻糖积累显著提高了菌株对发酵底物葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的耐受性,和对发酵产物乳酸和乙醇的耐受性,对丁醇的耐受性无明显改善。菌株对葡萄糖和乙醇的耐受性与其胞内海藻糖积累水平表现出一致性,胞内海藻糖含量越高,菌株对葡萄糖和乙醇的耐受性越强。评价了产乙醇重组菌的发酵性能。转化携带乙醇合成途径的质粒pEtac-PA后,成功构建了产乙醇重组大肠杆菌B0013-1031H-PA、JC31-PA和JC41-PA。在120 g/L较高的的葡萄糖条件下摇瓶发酵,海藻糖积累菌株JC31-PA表现出最优的发酵性能,其最大乙醇产量为50.6 g/L,较对照菌株提高了 5.42%;乙醇产率为48.72 g/100 g葡萄糖,较对照提高了 12.67%,达到理论得率的95%。在5L发酵罐上放大试验,乙醇产量为48 g/L,合成速率为0.75 g/L·h,乙醇产率为37.07 g/100 g葡萄糖。