近年来，肺腺癌发病率与致死率逐渐高于鳞状细胞癌类型，呈上升趋势。调查表明:肿瘤细胞的增殖后通过血管形成进行远处转移与播散依然是腺癌致死的主要原因。目前，对于非小细胞肺癌的治疗手段仍然停留在手术及术后的化疗这样一个传统治疗层面，然而，传统治疗手段治疗肺癌的理想效果仅仅能达到20-30％的五年生存率，要想从根本解决肺癌对人类的危害，非创伤性的早期检测手段即显得尤为重要。肿瘤细胞的转移是一个高度复杂的生物学过程，这个过程涉及多个蛋白的功能，而导致肺腺癌发病的蛋白协同方式和分子机制还尚不明确，探测肺腺癌中与转移有关的蛋白及其分子机制对于该肿瘤的早期诊断及其预后治疗干预是十分必要的。　　肺腺癌的转移是一个复杂的多步骤的过程，癌细胞要获得一些特殊性能才能使其跨越每一个屏障向远处转移。肿瘤分泌蛋白在肿瘤进展和转移中具有深刻的意义。不同分类的分泌蛋白，例如:蛋白酶，生长因子，细胞因子和血管生成因子等，均在各个环节参与肿瘤的进展和转移，像细胞外基质降解，细胞增殖，运动，生存，侵袭宿主免疫反应，血管再生等。因此，研究肿瘤分泌蛋白有可能在新的层面探测肿瘤标志物，为肿瘤的治疗提供新的治疗靶点。直接在人的血浆样本中探测标志物会遇到很多限制，比如高丰度血清蛋白，白蛋白，免疫球蛋白，纤维原蛋白，触珠蛋白等。这些高丰度蛋白会不可避免的掩盖一些低丰度蛋白，而标志物往往就蕴藏的低丰度蛋白中。因此，很多科研团队已经改变了研究策略转向选择一定的方法去研究肿瘤细胞的分泌蛋白进而探测肿瘤标志物。一些科研团队已经采用了以分泌组为基础的研究方法进行各种类型肿瘤标志物的检测。总的技术路线是:在无血清培养基里进行细胞培养，然后收集条件培养基进行浓缩进行蛋白质组学分析。通过研究所感兴趣的疾病的分泌组，我们将一些经过WB、IHC和ELISA验证的蛋白鉴定为潜在的肿瘤标志物。以上说明以分泌组为基础的研究策略去鉴定新型的肿瘤标志物的可行性。　　本次研究采用了8-plex iTRAQ结合2-D LC MALDI-TOF/TOF发现和比较肺腺癌细胞系Anip973和AGZY83a分泌组。Anip973和AGZY83a为同一来源的肺腺癌细胞系，前者具有高转移能力，而后者具有低转移能力。培养基中分泌蛋白比细胞自溶产物的丰度高，鉴于潜在的污染，我们利用软件进行了培养基中的细胞分泌蛋白和细胞本身自溶到培养基中的蛋白筛选。这将帮助我们避免挑选转移我们转移力的靶点进行下一步的验证工作。　　实验目的:　　本实验采用蛋白质组学方法中的非胶同位素标记相对与绝对定量技术标记肺腺癌同一来源的具有高低转移潜能的两个细胞系Anip973和AGZY83a，结合高效液相色谱质谱技术与生物信息学技术分析比较这两个细胞系的差异分泌蛋白表达。将鉴定到的与转移相关联的差异表达分泌蛋白进行进行蛋白水平的Westernblot、免疫学方面的免疫组织化学以及同位素临床血清学ELISA等验证前面得出的质谱数据，从而进一步阐明与肺腺癌转移相关的蛋白标志物，为进一步研究肺腺癌转移机制奠定基础。　　材料与方法:　　1、采用加入小牛垂体提取物的完全无血清培养基培养人肺腺癌细胞系Anip973与AGZY83a细胞系，在培养皿中无血清培养的细胞丰度达到约80％左右时，取培养基，1500rpm离心10分钟取上清以进行下一步的分泌蛋白提取。　　2、将收集的培养基装入一端夹子夹紧的直径3.5KD的透析袋中，8ml/袋，3-4袋，100mol NaCL2小时，50mol NaCL4小时，25mol NaCL8小时，10 molNaCL12小时，最后放入两蒸水中24小时之后放入-80℃过夜。过夜之后的固体状态的透析液真空冻干12小时-14小时直至固体粉末状态。　　3、改良的Bradford法测定蛋白样品的蛋白浓度的方法:　　(1)标准曲线测定;　　(2)样品测定;　　(3)数据处理;　　(4)检测样品蛋白含量;　　(5)蛋白样品溶液小量分装，-80℃保存。　　4、还原烷基化:DTT10mM，56℃1小时，IAM55mM，避光45分钟，使蛋白质结构破坏，便于酶切。　　5.消化:在前期所有优化基础上，使用Trypsin Gold(Promega)，酶:蛋白质=1∶30，37℃，共消化36小时，消化24小时之后，补加底物质量的1/100Trypsin　　6.MALDI检测峰图:(1)消化结束后，离心抽干肽段溶液使用等体积(30～50μl)Bissolution Buffer复溶;(2)将iTRAQ试剂恢复至室温，然后每管试剂加入60μl异丙醇，混匀并离心;(3)将混合后标记试剂加至各组肽段溶液中，混匀离心;(4)室温静置2小时;(5)标记后，将所有溶液合并。　　7.强阳离子交换柱:强酸性环境，使用磷酸盐缓冲液，将以阳离子混合物形式的肽段混合物与柱料上的金属阳离子进行交换吸附，采用逐步提高阳离子浓度的洗脱的方式将大部分肽段洗脱下来。　　8.标峰检索:合并生成的mgf文件，然后用自建mascot数据库进行检索。　　9.Scaffold分析结果:提取检索所得的data文件，导入Scaffold进行分析，所得结果，利用同位素小峰的强度进行定量，所得结果可进行方差分析和T-Test　　10.采用SignalP4.0与Secretome2.0软件进行经典分泌蛋白与非经典分泌蛋白的搜索。　　11.采用Blast2GO v.2.3.5软件对全部鉴定筛选到的差异分泌蛋白进行基因本体注释，分别在分子功能、生物学进程与分子组成方面对所得结果进行了一个整体概括。　　12.利用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)数据库对所鉴定与筛选到的82个差异分泌蛋白进行其功能的分析、参与的信号通路的分析与构建以及蛋白与蛋白之间的相互作用分析，发现了一些与转移密切相关的蛋白。　　13.提取Anip973与AGZY83a细胞系的分泌蛋白，采用Western blot的方法进行前述实验结果的验证，观察Western blot的结果是否与iTRAQ标记的质谱数据一致。　　14.免疫组织化学方法观察所筛选的差异表达的分泌蛋白APOE在没有发生淋巴结转移肺腺癌组织中与有淋巴结转移的肺腺癌组织中的表达差异情况。　　15.ELISA实验进行血清学验证APOE在正常人群、非恶性肺部疾病、肺鳞癌、肺腺癌中的表达情况。　　结果:　　1、质谱总体数据　　经iTRAQ标记的Anip973、AGZY83a和HBE三株细胞的分泌蛋白，经质谱鉴定后，在NCBI数据库中共搜索到492个差异表达蛋白。当CM fractions Ration(117/119，117/113，119/113)取＞1.5或＜0.667并且至少含有一个特异性肽段时，Anip973与AGZY83a比较的差异蛋白表达共161个，Anip973与HBE比较的差异蛋白表达共86个，AGZY83a与HBE比较的差异单蛋白表达共98个。　　2、比较分析Anip973与AGZY83a分泌组中的上调与下调蛋白利用SignalP4.0和Secretome2.0共筛选出经典与非经典分泌蛋白82个，其中Anip973中表达高于AGZY83a的蛋白27，AGZY83a中表达高于Anip973蛋白55个。　　3、基因本体注释与信号肽序列图　　基于基因本体数据库，iTRAQ标记的差异分泌蛋白被进行了三个分类:(1)蛋白参与的生物学进程;(2)分子功能预测;(3)蛋白的分子组成。（注:图表在后面文章正文给出）。　　4、生物信息学分析Anip973与AGZY83a差异表达分泌蛋白，鉴定APOE为转移相关联蛋白　　使用IPA数据库对Anip973与AGZY83a a的差异表达分泌蛋白进行功能，参与的经典路径、蛋白质与蛋白质之间的相互作用分析得出Anip973与AGZY83a相比较的82个差异分泌蛋白共参与91个生物学路径。本研究中，给出所涉及的前10位的参与路径（注:图表在后面文章正文给出）。基于KEGG数据库，我们得知APOE参与LXR/RXR Activation signaling，而此路径也参与非小细胞肺癌信号途径。我们的分析表明APOE蛋白在肺腺癌转移中可能扮演者及其重要的角色。　　5、Western blot验证APOE及与转移相关蛋白　　为了进一步验证iTRAQ标记的质谱鉴定结果，我们选取了与转移相关的蛋白APOE，MMP2，SERPINE1，VTN进行了验证，表达水平与iTRAQ标记的质谱鉴定结果一致。　　6、免疫组织化学分析　　利用30例/60点肺腺癌组织与30点/90例有淋巴结转移的肺腺癌组织观察APOE的表达情况，结果表明，APOE在有淋巴结转移的肺腺癌组织的表达式明显高于无淋巴结转移的肺腺癌组织(P=0.02，P＜0.05)(　　)6.ELISA分析APOE在健康人血清中、肺腺癌血清中、肺鳞癌血清中APOE的表达情况。结果在文章正文部分详细陈述。　　讨论:　　肺腺癌的转移发生的机制是一个复合分子参与复杂的生物学过程。尽管，在基因和转录水平一些关于肺腺癌转移机制方面的研究已经进行了很多年，但其确切机制还尚不明确。利用质谱为基础进行研究的蛋白质组学对于理解各类疾病功能及机制来说已经成为一种有用的新兴工具。近年来，使用基于蛋白质组学的无血清培养基进行肿瘤疾病的研究已经逐渐开展起来。在本次研究中，对高低转移潜能的同一来源的肺腺癌细胞系Anip973与AZGY83a分泌组的比较研究，所得结果进行进一步的验证这种实验设计，正符合目前研究肿瘤转移的模式。细胞系分泌组研究的主要困难就是细胞自溶导致的细胞内蛋白外漏导致的污染。先前进行的如:乳腺癌，大肠癌，前列腺癌的分泌组研究中已经指出条件培养基中有大部分鉴定出来的蛋白是细胞内蛋白。但是，也有一些细胞内蛋白经过某些机制被激活后，经过非经典途径的方式分泌出来。所以，从培养基里挑选真正的分泌蛋白是选择候选标志物的关键。在本研究中，我们将所有鉴定到的差异表达蛋白首先录入IPA数据库，进行了亚细胞定位。分泌蛋白是指:在细胞内合成，分泌到细胞外起作用的蛋白质，例如:唾液淀粉酶、胃蛋白酶、消化酶和抗体和一部分激素（注:呼吸酶不属于分泌蛋白）。在核糖体上合成的分泌蛋白，要经过内质网和高尔基复合体运输至细胞膜，而不是直接运输到细胞膜。进一步研究表明，在核糖体上翻译出的蛋白质，进入内质网腔后，还要经过一些加工，如折叠、组装、加上一些糖基团等才能成为比较成熟的蛋白质。o然后，由内质网腔膨大、出芽形成具膜的小泡，包裹着蛋白质转移到高尔基体，把蛋白质输送到高尔基体腔内，做进一步的加工。接着，高尔基体边缘突起形成小泡，把蛋白质包裹在小泡里，运输到细胞膜，小泡与细胞膜融合，把蛋白质释放到细胞外。在真核细胞中，内质网是最大的膜状结构的细胞器，其表面积可以是质膜面积的几倍。大部分的内质网与核糖体相结合形成糙面内质网，在糙面内质网上的核糖体是膜蛋白和分泌蛋白合成的地方，也是蛋白质分泌途径的起点。多肽经移位后，在内质网的小腔中被修饰，通过短时间的加工后，分泌蛋白形成被膜包裹的小泡，转运到高尔基体，然后再转运到细胞表面或溶酶体。因此，我们经过对分泌蛋白进行亚细胞定位，假设亚细胞定位在内质网的蛋白是分泌蛋白，出去这些蛋白之外，我们将其它蛋白利用SignalP4.0和Secretome2.0进行了预测，在Anip973与AGZY83a细胞分泌组的比较中，鉴定到上调差异分泌表达蛋白17，下调差异分泌表达蛋白34个。在Western blot进行验证的分泌蛋白中，作者选取了载脂蛋白APOE就它与临床的相关性进行了下一步验证。使用组织芯片进行免疫组织化学染色显示，APOE在无淋巴结转移的肺腺癌组织中表达阳性，而相应的癌旁组织也为阳性SPSS13.0分析P=0.194，P＞0.05无统计学差异;在原发性肺腺癌癌组织与具有淋巴结转移的肺腺癌组织的比较中有显著差异，SPSS13.0进行分析统计，得出P=0.02，(P＜0.05)，该结果表明，APOE在无淋巴结转移的肺腺癌组织与有淋巴结转移的肺腺癌中的表达有差异，具有统计学意义;在有淋巴结转移的肺腺癌旁组织与其原发灶的SPSS13.0分析中P=0.281，P＞0.05，无统计学差异;在有淋巴结转移的原发灶与转移淋巴结的SPSS13.0统计分中P=0.067，无统计学差异。　　由于，该研究的目的是进行肿瘤标志物的早期检测，因此我们还要进一步观察一下APOE在血清中的表达情况，我们选取了健康者血清61例，非恶性肺部疾病患者血浆39例，肺鳞癌患者血浆62例，其中无淋巴结转移血浆26例，有淋巴结转移患者36例;肺腺癌患者血浆108例，其中有淋巴结转移血浆51例，无淋巴结转移患者血浆57例。经SPSS13.0单因素方差分析(ANOVA)分析，我们得出，肺腺癌无淋巴结转移组与有淋巴结转组APOE表达的统计结果P=0.0002，(P＜0.01)，肺鳞癌无淋巴结转移组与有淋巴结转组APOE表达的统计结果P=0.94，(P＞0.05)，无统计学意义。并且，分析得出，肺腺癌有淋巴结转移组与其它几组:健康组、肺肿瘤性肺部疾病、肺鳞癌无淋巴结转移组和有淋巴结转移组的统计结果P值均小于0.01，均有统计学差异。　　APOE也称作AD2，AI255918，APOEA，Apolipoprotein E，LDLCQ5，LPG等，是一个具有299个氨基酸的糖基化蛋白，预测分子量34KD，曾经被报道在肝和脑中表达增高。APOE参与调节于心血管疾病相关联的脂质和胆固醇代谢转运。在肿瘤研究中，APOE在DNA合成、β-catenin定位，细胞增殖、抗氧化能力、血管增殖、转移等方面都有相关的报道。在临床方面，APOE被报道过在一些恶性肿瘤，如:膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌组织中表达增高。然而，APOE在肺腺癌转移中的研究和转移机制尚没有过相关报道，本研究利用组织芯片染色使APOE在肺腺癌中的表达是首次进行报道。基于芯片的数据得出，APOE在无淋巴结转移肺腺癌组织与相应的癌旁组织中的表达无明显差异(P=0.194，P＞0.05)，而APOE在无淋巴结转移的原发性肺腺癌组织中的表达与有淋巴结转移的肺腺癌组织中的表达有显著差异(P=0.02，P＜0.05).本研究首次在血浆中将APOE用于肺腺癌转移的相关评估。　　结论:　　1、本研究共鉴定差异表达分泌蛋白51个，其中在Anip973细胞系中上调17个，在AGZY83a中上调的34个。　　2、本研究挖掘出了肺腺癌的一组分泌蛋白，鉴定APOE为肺腺癌转移相关标志物。