【摘 要】
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纳豆激酶(nattokinase,NK)作为新一代的口服溶栓药物正受到全世界的瞩目.但是通过基因克隆的手段来增大纳豆激酶的表达量的研究还不很成熟,对于分泌型有活性纳豆激酶的研究更
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纳豆激酶(nattokinase,NK)作为新一代的口服溶栓药物正受到全世界的瞩目.但是通过基因克隆的手段来增大纳豆激酶的表达量的研究还不很成熟,对于分泌型有活性纳豆激酶的研究更是鲜见.我们采用纤维平板法,从广东、四川、云南等地的豆豉中筛选得到多株具有纤溶活性的菌株,对其中活性较高的YF038号菌株进一步研究表明,其菌落圆形,不透明,边缘有叶状齿.菌体呈杆状,可形成芽孢,芽孢中生,椭圆形.结合该菌生理生化特性和16S rDNA序列测定表明,它是一株枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis YF038.对PCR扩增产物的DNA序列分析表明B.subtilis YF038是NK产生菌.然后将克隆到的纳豆激酶成熟肽基因插入载体pET23b和pET26b,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达蛋白均以包涵体形式存在.通过多种方法也很难复性.将纳豆激酶的全部基因序列(包括信号肽,前肽及成熟肽的基因序列)插入载体pET23b,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,蛋白以活性形式分泌于细胞外发酵液.将纳豆激酶的基因序列(包括前肽及成熟肽)插入载体pET26b,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达时,蛋白仍以活性形式分泌于细胞外发酵液.说明大肠杆菌的信号肽序列也可以引导纳豆激酶的分泌.经过比较,克隆表达的外泌具活性纳豆激酶的浓度高于原枯草杆菌发酵分泌的纳豆激酶.而且,在大肠杆菌中表达时,大肠杆菌信号肽比枯草杆菌信号肽更有利于诱导纳豆激酶的分泌.此外初步研究了纳豆激酶的纯化条件,并在大肠杆菌BL21(DE3)(载体pET26b-NKP)发酵液中分离出电泳纯的纳豆激酶,蛋白大小与前期报道的内容一致.该研究对纳豆激酶的应用以及纯化生产等提供了重要的方法,同时也具有重要的理论意义.
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