论文部分内容阅读
目的:肺癌转移相关蛋白LCMR1是我们实验室采用mRNA差异显示技术克隆到的新基因(GenBank ID:AY148462),本课题拟通过原核表达获取LCMR1纯化融合蛋白质,并制备LCMR1抗体,然后在蛋白质水平研究LCMR1在多种组织和细胞中的表达,进一步研究该基因的功能。 方法:(1)优化pGEX-5T/LCMR1原核质粒的表达条件,使之在大肠杆菌系统稳定地表达融合蛋白GST-LCMR1,然后应用亲和层析技术纯化融合蛋白并通过wes tern B1ot免疫印迹和MALDI-TOF-MS技术对纯化的蛋白进行鉴定;(2)通过应用GST-LCMR1蛋白免疫新西兰兔和免疫原性肽抗体技术两种不同策略制备LCMR1抗体:(3)应用免疫组织化学技术和组织芯片技术对LCMR1在多种细胞和组织中的表达进行研究。 结果:(1)确定了LCMR1原核表达的关键表达参数:诱导温度为20℃、诱导时间为4h及诱导剂IPTG终浓度为0.6mmol/L,使之可以在大肠杆菌中稳定表达,并应用谷胱甘肽一琼脂糖亲和层析树脂成功纯化GST-LCMR1蛋白,其纯度可达到85%以上;(2)通过将纯化的GST-LCMR1融合蛋白免疫新西兰兔和免疫原性肽抗体技术两种不同策略成功制备了LCMR1抗体,并证实两种抗体均有较好的免疫活性和特异性;(3)LCMR1在人正常甲状腺组织和横纹肌组织以及卵巢癌组织中低表达,在95C和95D细胞以及在肺、胃、肝脏、心脏、结肠、食道和前列腺等多种正常和相应肿瘤组织中高表达,而且在95C和95D细胞以及人正常肌肉和心脏组织中主要表达在细胞浆,其余组织中主要表达在细胞核。 结论:(1)应用大肠杆菌系统成功表达了LCMR1融合蛋白质,并确定了GsT-LCMR1融合蛋白的高效下游纯化路线;(2)建立了两种不同的LCMR1抗体制备方法,获得了LCMR1抗体;(3)在蛋白质水平研究了LCMR1的组织表达,表明LCMR1在人类多种正常和肿瘤组织中高表达,提示其可能作为一个