目前，我国冠心病、急性心肌梗塞等缺血性心脏病的发病率与死亡率明显上升，严重危害人们健康。溶栓、介入、冠脉搭桥等再灌注疗法是治疗冠心病、急性心肌梗塞等缺血性心脏病最主要的措施，但这些治疗措施在带来有益治疗效果的同时，却会引起潜在的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤。因此，如何减轻甚至解除心肌I/R损伤受到广大基础和临床研究者的高度关注。针对心肌I/R损伤的保护，人们进行了积极的研究与探讨，从对心肌I/R损伤机制的研究，到心肌缺血预适应保护作用的探索，发展到药理性预适应心肌保护，已取得了许多令人鼓舞的成果，但距临床应用仍有一定的距离。我国中药资源极为丰富，如何从中发掘出更加安全有效的防治心肌I/R损伤的药物，特别是对其活性成分进行药效学及作用机制的研究是当前我国医药界所面临的一大课题。 为此，本研究拟从细胞水平，通过心肌细胞缺氧/复氧(anoxia/reoxygenation，A/R)损伤模型模拟在体I/R损伤，应用细胞生物学和基因转染及RNA干扰等分子生物学手段以期阐明SQS预处理所产生的抗心肌细胞A/R损伤作用与AE3蛋白表达的关系，明确AE3蛋白介导SQS抗心肌细胞A/R损伤的分子机制，并进一步明确SQS预处理上调AE3表达的信号通路，从而为进一步开发SQS提供理论和实验依据。 第一部分油茶皂苷预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤及AE3蛋白表达的影响 目的： 在观察SQS对原代心肌细胞A/R损伤保护作用的基础上，进一步观察SQS对A/R损伤所诱发的氧化应激、Ca2+超载、细胞凋亡等影响；同时观察SQS对A/R损伤心肌细胞内氯离子浓度以及AE3基因表达的影响，初步探讨AE3蛋白与SQS抗心肌细胞A/R损伤的相关性。 方法： 1.利用原代分离培养的新生大鼠心肌细胞，随机分为5组：①正常对照(Control)组，②缺氧/复氧组(A/R)，③0.1μM油茶皂苷预处理组(SQS—0.1)，④1μM油茶皂苷预处理组(SQS-1)，⑤10μM油茶皂苷预处理组(SQS-10)。除对照组外，均建立缺氧/复氧损伤模型。 2.MTT法检测各实验组心肌细胞的存活率；按试剂盒说明测定各组心肌细胞内LDH的活性、MDA的含量以及抗氧化物酶SOD、CAT、GSH—Px的活性；流式细胞术检测各实验组心肌细胞内ROS、游离钙以及氯离子浓度的变化；Annexin V—FITC/PI双染法检测各组心肌细胞凋亡率的改变。 3.RT—PCR半定量检测各实验组心肌细胞内AE3 mRNA的表达变化；Western Blot检测各组心肌细胞中AE3蛋白的表达。 4.统计学方法：应用SPSS11.0软件对数据进行方差分析和t检验以P<0.05作为判定统计学意义的标准。 结论： 1.在原代培养的心肌细胞水平上，再次证实SQS预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤具有保护作用，并呈现一定的剂量依赖性；同时SQS剂量依赖性地抑制缺氧/复氧所诱发的心肌细胞氧化应激、钙超载及细胞凋亡。 2.SQS预处理可上调缺氧/复氧心肌细胞AE3基因表达，同时抑制缺氧/复氧心肌细胞内氯过载。 3.AE3可能参与SQS抗心肌细胞缺氧/复氧损伤。 第二部分 RNA干扰技术沉默AE3基因对油茶皂苷抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响 目的： 构建靶向AE3的RNAi真核表达载体，建立AE3低表达的细胞系，观察AE3低表达对SQS抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响，反向验证AE3基因在这一过程中的重要作用及机制。 方法： 1.设计靶向AE3基因的3条候选RNA干扰序列，利用真核表达载体pSilencerTM3.1-H1 hygro构建重组质粒转染H9c2心肌样细胞；同时设计并构建靶向GAPDH基因的阳性对照及阴性对照RNA干扰重组载体，用于鉴定pSilencerTM3.1-H1 hygro质粒介导的RNA干扰体系的有效性。 2.瞬时转染后，RT—PCR和Western Blot检测AE3基因mRNA和蛋白表达，筛选最有效的RNA干扰靶片段；转染携带绿色荧光蛋白的pEGFP—Cl质粒，荧光显微镜监测瞬时转染不同时相的转染效率；将筛选出的抑制AE3表达最有效的重组载体用于稳定筛选低表达AE3基因的H9c2细胞，同时筛选稳定转染pSilencer—NC阴性对照载体的细胞作为对照；最后通过RT—PCR及Western Blot测定稳定筛选出的细胞中AE3基因mRNA和蛋白的表达。 3.SQS分别预处理未转染的H9c2细胞、稳定转染的阴性对照细胞H9c2/pSilencer—NC和AE3低表达的细胞系H9c2/pSilencer—siAE3，缺氧/复氧后，通过MTT法检测细胞存活率；化学比色法测定细胞内MDA含量以及抗氧化物酶SOD、CAT、GSH—Px的活性；流式细胞术检测细胞内ROS、游离钙以及氯离子浓度；Annexin V—FITC/PI双染法检测细胞凋亡率；分析AE3基因沉默前后SQS对上述指标影响的变化。 结论： 1.pSilencerTM3.1-H hygro质粒介导的RNA干扰体系能够有效抑制H9c2心肌样细胞中靶基因的表达。 2.针对AE3 mRNA序列521～541 bp位置设计并构建的RNA干扰重组载体pSilencer—AE3-A能够最有效抑制靶基因的表达，抑制率达75％以上。 3.成功构建的低表达AE3基因的H9c2/pSilencer—siAE3细胞，可用于AE3及相关基因功能分析的进一步研究。 4.利用AE3低表达的细胞系H9c2/pSilencer—siAE3，反向证实AE3介导了SQS对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用，其机制可能通过抑制缺氧/复氧心肌细胞内氯过载及减少细胞内ROS含量，进而抑制缺氧/复氧所致的氧化应激、钙超载及细胞凋亡，从而对缺氧/复氧损伤心肌细胞产生保护作用。 第三部分油茶皂苷预处理上调缺氧/复氧损伤心肌细胞AE3表达的信号机制 目的： 利用NO合成酶和ERK1/2抑制剂，从NO和ERK1/2途径初步探讨SQS上调缺氧/复氧损伤心肌细胞AE3基因表达的信号机制。 方法： 1.利用原代分离培养的薪生大鼠心肌细胞，随机分为5组：①正常对照(Control)组，②缺氧/复氧组(A/R)，⑨10μM油茶皂苷预处理组(SQS-10)，④NO抑制剂L—NAME处理组(L—NAME)，⑤ERK1/2抑制剂PD98059处理组(PD98059)。除对照组外，均建立缺氧/复氧损伤模型。 2.MTT比色法检测各实验组心肌细胞的存活率；利用全自动生化分析仪测定各组心肌细胞培养液中LDH的活性；硝酸还原酶法测定各组心肌细胞培养液中NO的浓度；Western Blot检测ERK1/2蛋白和磷酸化ERK1/2蛋白的表达水平。 3.RT—PCR半定量检测各实验组心肌细胞内AE3 mRNA的表达变化；Western Blot检测各组心肌细胞中AE3蛋白的表达。 4.统计学方法：应用SPSS11.0软件对数据进行方差分析和t检验以P<0.05作为判定统计学意义的标准。 结论： SQS预处理上调缺氧/复氧心肌细胞内AE3的表达涉及NO和ERK1/2信号途径。 论文意义： 1.本研究在心肌细胞水平上，进一步验证了SQS可剂量依赖性地对抗心肌细胞缺氧/复氧损伤；同时研究发现SQS可抑制心肌细胞缺氧/复氧损伤所诱发的氧化应激、钙超载和细胞凋亡。 2.本研究率先提出了SQS抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的新机制。即SQS可能通过ERK1/2信号途径上调AE3基因表达从而降低缺氧/复氧损伤心肌细胞内[Cl—]i及ROS水平，进而抑制缺氧/复氧所致的氧化应激、钙超载及细胞凋亡，最终对缺氧/复氧损伤心肌细胞产生保护作用。 3.本研究所建立的AE3低表达的H9c2细胞系，将为进一步研究AE3蛋白功能、筛选SQS类似药物、研究SQS类似药物作用机制奠定了实验基础。 4.本研究不仅有助于国内外医药界对SQS心肌保护作用和机制的认识，而且尚可提示其它类似结构的中药有效成份也可能存在心肌保护作用，为寻找心肌保护药物探索了一条新的思路。