百菌清(又名四氯间苯二腈)是一种非内吸性广谱氯代苯腈类杀菌剂,由于其对农作物的真菌病害具有广谱性,现已成为世界上使用量最大的杀真菌剂之一。2016最新数据显示,我国百菌清产量达8000吨。百菌清是一种有毒的有机氣农药,在自然环境中理化性质稳定,并且具有明显的蓄积性,其在土壤、水体及作物中的残留会导致农田土壤、农产品的污染和抑制生物质转化等问题,对生态环境、人类健康和食品安全造成影响。因此,受污染环境的修复及残留的消除逐渐引起人们的重视。本实验室前期分离到一株高效降解百菌清菌株Pseudomonassp.CTN-3并从中获得了百菌清水解脱氣酶(Chd),其能够在没有任何辅因子的条件下,直接将百菌清水解为毒性低、水溶性大的产物羟基百菌清,为百菌清污染的修复提供良好的材料。因此,本论文对其展开研究:(1)利用同源重组方法将chd基因整合到枯草芽孢杆菌BacillussubtilisWB800染色体上,代替其原有的淀粉酶基因,在含壮观霉素(Spc)的百菌清平板上挑转化子WB800-chd,成功实现chd基因在枯草芽孢杆菌WB800中稳定的胞外分泌表达,解决了百菌清水解脱氣酶(Chd)表达不稳定难题。(2)系统比较了ch 基因定位于质粒上的菌株WB800(pP43Chd)和染色体上的菌株WB800-chd的产酶发酵参数。由于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtis)在30℃到37℃下都能生长,进行温度比较实验,发现菌株WB800-chd和WB800(pP43Chd)在37℃时比30℃时生物量增加了 13%。进一步在优化的最佳条件下,进行摇瓶发酵实验,分别获得菌株WB800(pP43Chd)和菌株WB800-chd的生长曲线、酶活曲线和稳定性数据。研究结果显示菌株WB800(pP43Chd)的最高酶活达到16.54U/L,而菌株WB800-chd的最高酶活为10.63U/L,相比较降低55%。但稳定性实验中菌株WB800-chd相对于菌株 WB800(pP43Chd)更稳定。(3)比较了菌株WB800-chd和WB800(pP43Chd)的发酵培养时间、残糖量、酶活和稳定性。菌株WB800(pP43Chd)在20h发酵周期内,葡萄糖含量利用了 96%,酶活最高达到22.30 U/L,稳定性从第一代的94%降至第六代的45%。而菌株WB800-chd发酵周期为27 h,发酵时间更长。葡萄糖含量由起始加入的50 g/L下降到0.04 g/L,利用了 99.8%;酶活最高达到13.00U/L,虽然相对酶活低,但稳定性从第一代的98%降到第六代的95%,相同条件比菌株WB800(pP43Chd)稳定性提高了 一倍。(4)研究酶制剂的保藏条件。结果显示超滤浓缩法保藏的酶制剂活性降低51%,直接冰箱保藏法和冷冻干燥保藏法分别降低了 70%和92%。因此,在两个月的保藏时间内,超滤浓缩法保藏效果最好,酶活比直接冰箱保藏法高43%,比冷冻干燥保藏法高出80%。(5)由于百菌清的残留不仅造成环境的污染也会导致生物质转化的效率降低,因此将发酵获得的百菌清水解脱氯酶Chd,用于解除百菌清对小麦秸秆酶解和固态发酵的影响。研究结果表明:当添加120 μng/mL的百菌清,对小麦秸秆纤维素酶和漆酶酶解的抑制最强,抑制率达到45%。添加60μ/g的Chd后,可显著消除百菌清的抑制作用,当百菌清浓度为120 μg/mL时抑制率下降到12%。同样,在固态发酵中,在百菌清浓度最高为50μg/mL时,抑制率达到35%,添加60μμl/g的Chd后抑制减小到8%。本研究制备的稳定表达的百菌清水解脱氯(Chd),能有效解除百菌清在生物质转化中的抑制效应,为百菌清污染环境的生物修复和生物质转化效率的提高提供有效途径。