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目的：
本研究经在体实验，以载脂蛋白 E基因（Apo E-/-）敲除小鼠为动物模型，明确三七皂苷R1（Notoginsenoside R1，NR1）通过诱导自噬，调节脂质代谢、介导氧化应激、抑制炎症反应，改善动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS)的作用。并经离体实验，以自噬为切入点，深入探讨NR1经PI3k/Akt/mTOR信号通路诱导自噬促进巨噬细胞由M1型向M2型转化减轻炎症反应的作用及机制，为AS的靶点治疗提供新的理论依据。
方法：
1、理论部分：回顾了自噬作为一种调节方式改善AS病变的研究进展；深入分析了在介导炎症反应过程中自噬与巨噬细胞表型转化的相关性；参考NR1在心血管和神经系统疾病中的研究；并结合扶正祛邪理论探讨自噬与AS中医病机的关联；为诠释AS的中医治疗原则及基于自噬探讨NR1调控巨噬细胞表型转化抗AS提供理论依据。
2、体内实验：ApoE-/-小鼠高脂饲喂12周建立AS模型，随机分为:空白组,不作特殊给药;NR1组,每日按25mg/kg行腹腔注射；vehicle组：每日腹腔注射与NR1组等体积的PBS，持续8周。①称量小鼠体重；②自动生化仪：测定甘油三酯（triglycerides，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）；③生化试剂盒：测定谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase， GSH-Px)、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）和丙二醛（malondialdehyde, MDA）；④酶联免疫吸附实验检测白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-10(interleukin-10， IL-10)；⑤苏木精伊红染色法(hematoxylin eosin staining，HE)检测主动脉根部斑块面积；⑥油红 O染色检测主动脉斑块脂质沉积；⑦天狼猩红染色（Picric Sirius red，PSR）检测斑块胶原纤维含量。⑧免疫荧光法：检测CD68、α-平滑肌肌动蛋白（smooth muscle-actin，α-SMA）。⑨透射电子显微镜：观察自噬超微结构；⑩Western blot法：检测血管中p62、LC3Ⅱ/Ⅰ的表达及PI3k/Akt/mTOR信号通路中各因子及其磷酸化水平。
3、体外实验：培养巨噬细胞，CCK8法测定细胞生存能力；将细胞随机分为：空白组、AngⅡ模型组、NR1组、Rapa组、3-MA组、3-MA+NR1组。并用LPS、IL-4诱导巨噬细胞向M1、M2分化后给予NR1处理细胞。①透射电子显微镜：观察自噬的超微结构；②Western blot法：检测p62、LC3Ⅱ/Ⅰ及PI3k/Akt/mTOR信号通路中各因子及其磷酸化水平；③流式细胞技术：检测CD16/32、CD206的表达；④ELISA法：检测细胞上清液中IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-10的水平。
结果：
1、体内实验：ApoE-/-小鼠高脂饲喂12周后成功建立动脉粥样硬化模型。①体重变化：各组小鼠的体重在同时段比较无显著性差异（P＞0.05）。②脂质代谢指标：治疗前各组小鼠 TC、TG、HDL-C、LDL-C无显著差异（P＞0.05）。治疗后：与同组比较，各组小鼠血清TC、TG、LDL-C均有明显下降(P＜0.01)，HDL-C无明显变化（P＞0.05）；三组相比，NR1组在降低血清TC、TG、LDL-C方面优于空白组和vehicle组(P＜0.01)。③氧化应激指标：与空白组和vehicle组相比，NR1可显著升高SOD和GSH－PX活性，又可降低MDA含量(P＜0.01)。④炎症反应指标：与空白组和vehicle组相比，NR1组血清中 IL-6含量降低，IL-10含量升高(P＜0.01)。⑤ HE染色：与空白组和vehicle组相比，NR1能明显减少主动脉根部AS斑块面积(P＜0.01)。⑥油红 O染色：与空白组和vehicle组相比，NR1能明显减少 AS斑块内脂质积聚(P＜0.01)。⑦ PSR染色：与空白组和vehicle组相比，NR1组斑块内弹力膜的胶原纤维明显增厚。⑧免疫荧光检测：与空白组和vehicle组相比，NR1能显著减少 AS斑块内的巨噬细胞浸润，同时增加主动脉壁内 VSMC的含量。⑨透射电镜：与空白组和vehicle组相比，NR1组自噬体增加，自噬现象明显。⑩Western blot法：与空白组和vehicle组相比，NR1能明显上调LC3Ⅱ/Ⅰ的水平(P＜0.01)，抑制P62蛋白水平(P＜0.01)；NR1组p-Akt和p-mTOR表达量均显著减少(P＜0.01)，而总Akt和总mTOR蛋白表达量没有显著性差异（P＞0.05）。
2、体外实验：（1）NR1调控巨噬细胞自噬及表型的关系：①CCK8结果：50uM NR1孵育24h时细胞存活率最佳；②透射电镜：NR1组与Rapa组中可观察到自噬体增加，其余实验组自噬现象不明显；③Western blot法：与空白组相比，模型组LC3Ⅱ/Ⅰ的比值减小(P＜0.01)，p62蛋白含量增加(P＜0.01)；与模型组相比，NR1组p62表达显著降低(P＜0.01)，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化增强（P＜0.01），且p62的降解和LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化与阳性药Rapa组相当（P＞0.05）。3-MA组LC3Ⅱ/Ⅰ的比值低下，高表达p62蛋白，3-MA与NR1共处理组，蛋白表达水平与3-MA单独处理组相似，而与NR1组相比，LC3Ⅱ/Ⅰ的比值减小(P＜0.01)，p62蛋白含量增加(P＜0.01)。与模型组相比，Rapa组、NR1组p-Akt和p-mTOR表达量均显著减少（P＜0.01），而总Akt和总mTOR蛋白表达量没有显著性差异（P＞0.05）。④流式细胞术：与空白组比较，模型组CD16/32表达显著增加（P＜0.01）,而CD206的表达两组间差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比， NR1组CD16/32表达显著减少（P＜0.01），CD206表达显著增加（P＜0.01），NR1组与Rapa组相比无统计学差异（P＞0.05）；3-MA组CD16/32和CD206表达与模型组相似（P＞0.05）；3-MA与NR1共处理时，结果与3-MA单独处理组相似（P＞0.05），而与NR1组相比， CD16/32表达显著增加（P＜0.01），CD206表达显著减少（P＜0.01）。⑤ELISA法：与空白组相比，模型组IL-6、IFN-γ和TNF-α水平显著升高（P＜0.01），而IL-10水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，NR1组IL-6、IFN-γ和TNF-α水平显著下降（P＜0.01）， IL-10水平显著上升（P＜0.01），且结果与Rapa组相当（P＞0.05）；3-MA组各炎症因子水平与模型组相似（P＞0.05）；3-MA与NR1共处理时，结果与3-MA单独处理组相似（P＞0.05），而与NR1组相比， IL-6、IFN-γ和TNF-α水平显著升高(P＜0.01)，IL-10水平下降(P＜0.01)。（2）NR1对M1、M2型巨噬细胞的影响：我们用LPS及IL-4在体外构建了M1、M2型巨噬细胞进行实验。①流式细胞术：LPS诱导后巨噬细胞高表达CD16/32，低表达CD206，呈M1型，NR1干预后， CD16/32表达降低，CD206表达升高（P＜0.01）；IL-4诱导后巨噬细胞高表达CD206，低表达CD16/32，呈M2型，NR1给药后，CD206及CD16/32表达无明显变化（P＞0.05）；②ELISA法：M1型巨噬细胞高表达IL-6、IFN-γ和TNF-α，NR1干预后下降（P＜0.01），低表达IL-10，NR1干预后升高（P＜0.01）；M2型巨噬细胞高表达IL-10，低表达IL-6、IFN-γ和TNF-α，NR1干预后,各因子水平无明显变化（P＞0.05）。③Western blot法：对于M1型巨噬细胞，NR1干预后， p62水平表达降低（P＜0.01），LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高（P＜0.01）；而对于M2型巨噬细胞，NR1干预前后，自噬相关蛋白p62及LC3均无明显差异（P＞0.05）。④透射电镜：LPS+NR1组自噬体增加，自噬现象明显；其余三组自噬现象不明显。
结论：
1、NR1改善ApoE-/-小鼠AS病变的效果明确，可以抑制斑块内脂质沉积，影响AS斑块成分，使斑块内弹力膜的胶原纤维增厚，巨噬细胞浸润减少，VSMC增加，抑制斑块形成，促使斑块趋向稳定。
2、NR1抗AS的作用与调节脂质代谢、介导氧化应激、抑制炎症反应有关。
3、NR1具有提高自噬水平的能力，并主要通过促进M1型巨噬细胞自噬使其向M2型转化，在抗AS过程中发挥抗炎作用。
4、NR1促进巨噬细胞自噬调控其表型转化的作用机制可能与选择性抑制PI3k/Akt/mTOR信号通路有关。
本研究经在体实验，以载脂蛋白 E基因（Apo E-/-）敲除小鼠为动物模型，明确三七皂苷R1（Notoginsenoside R1，NR1）通过诱导自噬，调节脂质代谢、介导氧化应激、抑制炎症反应，改善动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS)的作用。并经离体实验，以自噬为切入点，深入探讨NR1经PI3k/Akt/mTOR信号通路诱导自噬促进巨噬细胞由M1型向M2型转化减轻炎症反应的作用及机制，为AS的靶点治疗提供新的理论依据。
方法：
1、理论部分：回顾了自噬作为一种调节方式改善AS病变的研究进展；深入分析了在介导炎症反应过程中自噬与巨噬细胞表型转化的相关性；参考NR1在心血管和神经系统疾病中的研究；并结合扶正祛邪理论探讨自噬与AS中医病机的关联；为诠释AS的中医治疗原则及基于自噬探讨NR1调控巨噬细胞表型转化抗AS提供理论依据。
2、体内实验：ApoE-/-小鼠高脂饲喂12周建立AS模型，随机分为:空白组,不作特殊给药;NR1组,每日按25mg/kg行腹腔注射；vehicle组：每日腹腔注射与NR1组等体积的PBS，持续8周。①称量小鼠体重；②自动生化仪：测定甘油三酯（triglycerides，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）；③生化试剂盒：测定谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase， GSH-Px)、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）和丙二醛（malondialdehyde, MDA）；④酶联免疫吸附实验检测白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-10(interleukin-10， IL-10)；⑤苏木精伊红染色法(hematoxylin eosin staining，HE)检测主动脉根部斑块面积；⑥油红 O染色检测主动脉斑块脂质沉积；⑦天狼猩红染色（Picric Sirius red，PSR）检测斑块胶原纤维含量。⑧免疫荧光法：检测CD68、α-平滑肌肌动蛋白（smooth muscle-actin，α-SMA）。⑨透射电子显微镜：观察自噬超微结构；⑩Western blot法：检测血管中p62、LC3Ⅱ/Ⅰ的表达及PI3k/Akt/mTOR信号通路中各因子及其磷酸化水平。
3、体外实验：培养巨噬细胞，CCK8法测定细胞生存能力；将细胞随机分为：空白组、AngⅡ模型组、NR1组、Rapa组、3-MA组、3-MA+NR1组。并用LPS、IL-4诱导巨噬细胞向M1、M2分化后给予NR1处理细胞。①透射电子显微镜：观察自噬的超微结构；②Western blot法：检测p62、LC3Ⅱ/Ⅰ及PI3k/Akt/mTOR信号通路中各因子及其磷酸化水平；③流式细胞技术：检测CD16/32、CD206的表达；④ELISA法：检测细胞上清液中IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-10的水平。
结果：
1、体内实验：ApoE-/-小鼠高脂饲喂12周后成功建立动脉粥样硬化模型。①体重变化：各组小鼠的体重在同时段比较无显著性差异（P＞0.05）。②脂质代谢指标：治疗前各组小鼠 TC、TG、HDL-C、LDL-C无显著差异（P＞0.05）。治疗后：与同组比较，各组小鼠血清TC、TG、LDL-C均有明显下降(P＜0.01)，HDL-C无明显变化（P＞0.05）；三组相比，NR1组在降低血清TC、TG、LDL-C方面优于空白组和vehicle组(P＜0.01)。③氧化应激指标：与空白组和vehicle组相比，NR1可显著升高SOD和GSH－PX活性，又可降低MDA含量(P＜0.01)。④炎症反应指标：与空白组和vehicle组相比，NR1组血清中 IL-6含量降低，IL-10含量升高(P＜0.01)。⑤ HE染色：与空白组和vehicle组相比，NR1能明显减少主动脉根部AS斑块面积(P＜0.01)。⑥油红 O染色：与空白组和vehicle组相比，NR1能明显减少 AS斑块内脂质积聚(P＜0.01)。⑦ PSR染色：与空白组和vehicle组相比，NR1组斑块内弹力膜的胶原纤维明显增厚。⑧免疫荧光检测：与空白组和vehicle组相比，NR1能显著减少 AS斑块内的巨噬细胞浸润，同时增加主动脉壁内 VSMC的含量。⑨透射电镜：与空白组和vehicle组相比，NR1组自噬体增加，自噬现象明显。⑩Western blot法：与空白组和vehicle组相比，NR1能明显上调LC3Ⅱ/Ⅰ的水平(P＜0.01)，抑制P62蛋白水平(P＜0.01)；NR1组p-Akt和p-mTOR表达量均显著减少(P＜0.01)，而总Akt和总mTOR蛋白表达量没有显著性差异（P＞0.05）。
2、体外实验：（1）NR1调控巨噬细胞自噬及表型的关系：①CCK8结果：50uM NR1孵育24h时细胞存活率最佳；②透射电镜：NR1组与Rapa组中可观察到自噬体增加，其余实验组自噬现象不明显；③Western blot法：与空白组相比，模型组LC3Ⅱ/Ⅰ的比值减小(P＜0.01)，p62蛋白含量增加(P＜0.01)；与模型组相比，NR1组p62表达显著降低(P＜0.01)，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化增强（P＜0.01），且p62的降解和LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化与阳性药Rapa组相当（P＞0.05）。3-MA组LC3Ⅱ/Ⅰ的比值低下，高表达p62蛋白，3-MA与NR1共处理组，蛋白表达水平与3-MA单独处理组相似，而与NR1组相比，LC3Ⅱ/Ⅰ的比值减小(P＜0.01)，p62蛋白含量增加(P＜0.01)。与模型组相比，Rapa组、NR1组p-Akt和p-mTOR表达量均显著减少（P＜0.01），而总Akt和总mTOR蛋白表达量没有显著性差异（P＞0.05）。④流式细胞术：与空白组比较，模型组CD16/32表达显著增加（P＜0.01）,而CD206的表达两组间差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比， NR1组CD16/32表达显著减少（P＜0.01），CD206表达显著增加（P＜0.01），NR1组与Rapa组相比无统计学差异（P＞0.05）；3-MA组CD16/32和CD206表达与模型组相似（P＞0.05）；3-MA与NR1共处理时，结果与3-MA单独处理组相似（P＞0.05），而与NR1组相比， CD16/32表达显著增加（P＜0.01），CD206表达显著减少（P＜0.01）。⑤ELISA法：与空白组相比，模型组IL-6、IFN-γ和TNF-α水平显著升高（P＜0.01），而IL-10水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，NR1组IL-6、IFN-γ和TNF-α水平显著下降（P＜0.01）， IL-10水平显著上升（P＜0.01），且结果与Rapa组相当（P＞0.05）；3-MA组各炎症因子水平与模型组相似（P＞0.05）；3-MA与NR1共处理时，结果与3-MA单独处理组相似（P＞0.05），而与NR1组相比， IL-6、IFN-γ和TNF-α水平显著升高(P＜0.01)，IL-10水平下降(P＜0.01)。（2）NR1对M1、M2型巨噬细胞的影响：我们用LPS及IL-4在体外构建了M1、M2型巨噬细胞进行实验。①流式细胞术：LPS诱导后巨噬细胞高表达CD16/32，低表达CD206，呈M1型，NR1干预后， CD16/32表达降低，CD206表达升高（P＜0.01）；IL-4诱导后巨噬细胞高表达CD206，低表达CD16/32，呈M2型，NR1给药后，CD206及CD16/32表达无明显变化（P＞0.05）；②ELISA法：M1型巨噬细胞高表达IL-6、IFN-γ和TNF-α，NR1干预后下降（P＜0.01），低表达IL-10，NR1干预后升高（P＜0.01）；M2型巨噬细胞高表达IL-10，低表达IL-6、IFN-γ和TNF-α，NR1干预后,各因子水平无明显变化（P＞0.05）。③Western blot法：对于M1型巨噬细胞，NR1干预后， p62水平表达降低（P＜0.01），LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高（P＜0.01）；而对于M2型巨噬细胞，NR1干预前后，自噬相关蛋白p62及LC3均无明显差异（P＞0.05）。④透射电镜：LPS+NR1组自噬体增加，自噬现象明显；其余三组自噬现象不明显。
结论：
1、NR1改善ApoE-/-小鼠AS病变的效果明确，可以抑制斑块内脂质沉积，影响AS斑块成分，使斑块内弹力膜的胶原纤维增厚，巨噬细胞浸润减少，VSMC增加，抑制斑块形成，促使斑块趋向稳定。
2、NR1抗AS的作用与调节脂质代谢、介导氧化应激、抑制炎症反应有关。
3、NR1具有提高自噬水平的能力，并主要通过促进M1型巨噬细胞自噬使其向M2型转化，在抗AS过程中发挥抗炎作用。
4、NR1促进巨噬细胞自噬调控其表型转化的作用机制可能与选择性抑制PI3k/Akt/mTOR信号通路有关。