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核糖体(ribosome)是执行蛋白质生物合成的分子机器，核糖体蛋白(ribosomal protein，RP)是组成核糖体的主要成分。核糖体蛋白除参与蛋白质合成，还与细胞其它生理进程和核糖体外功能相关。核糖体蛋白基因是核糖体蛋白的编码基因，近年来有关核糖体蛋白基因的结构和功能研究取得了较大的进展。随着越来越多的核糖体蛋白基因从不同物种中被鉴定出来，核糖体蛋白基因已成为比较基因组学、基因组进化和系统发育研究的重要分子标记。然而，由于核糖体蛋白基因数量繁多，大多数物种尚未进行基因组测序，使得了解其在不同物种中的完整序列信息和基因组分布非常困难，且在多数脊椎动物中还没有被全面鉴定过，其系统演化还不清晰。鱼类作为脊椎动物中种类最大的类群，过去由于基因组序列的缺乏，绝大多数鱼类的核糖体蛋白基因数量至今尚不清楚。有关核糖体蛋白基因在脊椎动物中的表达和功能研究大多集中在少数模式动物，且局限于单个基因的研究，大部分核糖体蛋白基因在硬骨鱼类中的表达模式和功能仍不清楚。那么，在不同分类地位的鱼类中，其核糖体蛋白基因数量及其在基因组中的分布规律如何？核糖体蛋白基因在硬骨鱼类不同组织中的表达模式如何？其表达模式在机体受到不同外界环境条件影响下是否发生改变？这些问题迄今为止尚未得到解决。本研究从全基因组水平对包括尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)在内的13种代表动物的核糖体蛋白基因开展了全面的鉴定，并进行了系统发育分析。同时，从转录组水平对核糖体蛋白基因在硬骨鱼类中的表达模式进行了分析。研究结果有助于揭示核糖体蛋白基因在脊椎动物中的系统演化规律，为进一步开展核糖体蛋白基因在硬骨鱼类中的功能研究提供依据。具体研究结果如下：
1)脊椎动物核糖体蛋白基因的鉴定及基因组定位
在海鞘(Ciona intestinalis)、七鳃鳗(Petromyzon marinus)、腔棘鱼(Latimeria chalumnae)、人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、斑点雀鳝(Lepisosteus oculatus)、斑马鱼(Danio rerio)、鲤鱼(Cyprinus carpio)、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、大西洋鲑(Salmo salar)、青鳉(Oryzias latipes)、尼罗罗非鱼和红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)共13种代表动物的基因组中分别发现了79、64、86、84、83、80、85、125、90、148、88、92和86个核糖体蛋白基因。脊椎动物核糖体蛋白基因的数量在经过第二轮和第三轮基因组复制(Second and third round of genome duplication，2R and 3R)后数量变化不大，而在真骨鱼类经过第四轮基因组复制(Fourth round of genome duplication，4R)后数量显著扩张。氨基酸序列比较分析发现，尼罗罗非鱼核糖体蛋白基因与青鳉、红鳍东方鲀、斑马鱼和人的相似性分别为97%、96.5%、94.1%和92.7%，在不同物种中高度保守。基因组定位发现，尼罗罗非鱼92个核糖体蛋白基因散布在22个连锁群(linkage groups，LG)上，每个连锁群携带1个或多个基因。进一步在其它硬骨鱼类中进行基因组定位发现，部分核糖体蛋白基因在基因组上形成基因簇，这种基因分布规律在蝶形目、月鱼目、鲈形目、刺鱼目和鳉形目之间，以及在鲤形目、鲇形目和脂鲤目之间是高度保守的，表明核糖体蛋白基因在染色体上排列顺序的差异可以作为鲈形总目和骨鳔总目的鉴别分子标记，为研究分子进化提供了一条新的途径。
2)脊椎动物核糖体蛋白基因的系统进化分析
系统进化和共线性分析发现，大多数核糖体蛋白基因的复制基因在经历了2R事件后在脊椎动物演化过程中发生了丢失，但RPL3、RPL7、RPL22和RPS27经过2R后在脊椎动物中保留了下来，RPS17、RPS27、RPL5、RPL19、RPL22、RPL41和RPLP2在真骨鱼类中经过3R后保留了下来，RPS27和RPL22既经历了2R也经历了3R并保留了下来。部分基因如RPS27、RPL5、RPL7、RPL22、RPLP2在鲤鱼和大西洋鲑中甚至经历4R后被保留了下来。此外，首次在尼罗罗非鱼中发现10个核糖体蛋白具有复制基因。其中，RPS17、RPS19、RPL3、RPL5、RPL7、RPL19、RPL41和RPLP2均有2个复制基因，RPL22有3个复制基因，RPS27有4个复制基因。我们在尼罗罗非鱼中新发现RPS19的复制基因，该复制基因仅在鲈形总目的鱼类中存在，而在其它鱼类中没有发现，表明RPS19来源于鲈形总目鱼类谱系特异性复制。
3)核糖体蛋白基因在硬骨鱼类成鱼组织中的表达模式分析
基于尼罗罗非鱼成鱼8个不同组织和南方鲇(Silurus meridionalis)成鱼10个不同组织的转录组分析发现，全部核糖体蛋白基因在所有组织中均有表达，但其表达水平在不同组织中存在差异，在不同鱼类的同一组织中的表达水平也存在差异。在尼罗罗非鱼肝脏中的表达水平最高，卵巢中的表达水平最低；而在南方鲇卵巢中的表达水平最高，脾脏中的表达水平最低。在尼罗罗非鱼中，RPL38在脑、心脏、肾脏、肝脏和头肾中的表达水平最高，RPS12在卵巢、精巢和肌肉中的表达水平最高；相反，RPL3-2在脑、心脏、肾脏、肝脏、精巢和卵巢中的表达水平最低，RPS19b在肌肉和头肾中的表达水平最低。在南方鲇中，RPL39在脑、鳍条、心脏、肾脏、头肾和脾脏中的表达水平最高，RPLP1在肝脏、胰脏和精巢中的表达水平最高，RPL21在卵巢中的表达水平最高；相反，RPL3-2在所有组织中的表达水平最低。我们的qPCR验证实验结果与转录组分析结果一致。本研究结果进一步证实核糖体蛋白基因广泛参与到各种组织细胞的生理过程中，其表达水平可以随着细胞需求及蛋白质生物合成需求的变化而变化，反映出组织的不同代谢活性。
4)核糖体蛋白基因在硬骨鱼类不同发育时期性腺中的表达模式分析
本研究通过对尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、南方鲇和多鳞白甲鱼(Onychostoma macrolepis)共4种硬骨鱼类不同发育时期的性腺转录组分析发现，所有的核糖体蛋白基因在性腺中均有表达，但其表达水平在不同性别和不同发育时期的性腺中存在差异，没有发现性别或发育阶段特异性核糖体蛋白基因。核糖体蛋白基因在尼罗罗非鱼孵化后5天(days after hatch，dah)和奥利亚罗非鱼5和10dah性腺中的表达模式相似，二者都是在雌性中的表达水平高于雄性，而在其它发育时期呈现出雄性高于雌性的表达模式；在南方鲇120、360和540dah以及在多鳞白甲鱼成鱼中都呈现出雄性高于雌性的表达模式。进一步分析发现，核糖体蛋白基因的表达模式与性类固醇合成酶基因的表达模式基本一致，其表达水平与性类固醇激素合成水平呈正相关。此外，我们在尼罗罗非鱼中还发现11个核糖体蛋白基因呈现表型性别依赖型表达模式。qPCR和免疫组化验证分析表明，RPL5b在卵巢中的表达量高于精巢，而RPL24在精巢中的表达量高于卵巢，该结果与转录组分析结果一致。研究结果表明，核糖体蛋白基因在性腺中的表达模式并不是一成不变的，而是受性类固醇激素的影响，随着性腺发育过程中对于性类固醇激素合成的种类和数量的需求变化而适应调整。
5)抑制剂处理和翻译延伸因子突变罗非鱼性腺中核糖体蛋白基因的表达分析
本研究通过对芳香化酶抑制剂Fadrozole和黄体酮受体抑制剂RU486分别处理XX尼罗罗非鱼的性腺转录组分析发现，与正常XX相比，大多数核糖体蛋白基因在Fadrozole_XX和RU486_XX性腺中的表达水平上调，其中分别有6个(7%)和64个(70%)基因的表达水平显著上调，各有2个(2%)基因的表达水平显著下调。与正常XY相比，在Fadrozole_XX性腺中有90个(98%)基因的表达水平下调，其中有57个(62%)基因的表达水平显著下调，1个基因的表达水平显著上调；在RU486_XX性腺中有53个(58%)基因的表达水平上调，仅发现1个基因(RPS19b)的表达水平显著上调，1个基因(RPL38)的表达水平显著下调。研究结果表明，核糖体蛋白基因在不同抑制剂处理性腺中的表达模式存在差异，其表达水平受到抑制剂处理的影响。
本研究通过对尼罗罗非鱼eEF1A1b+/-(翻译延伸因子eEF1A1b杂合突变)精巢和42Sp50-/-(翻译延伸因子42Sp50纯合突变)卵巢的转录组分析发现，绝大多数核糖体蛋白基因的表达上调，其中有11个基因在eEF1A1b+/-精巢中的表达水平显著上调，29个基因在42Sp50-/-卵巢中的表达水平显著上调，均没有发现显著下调表达的基因。其中，RPS3、RPL18A和RPL37在eEF1A1b+/-精巢和42Sp50-/-卵巢中均显著上调。研究结果表明，核糖体蛋白基因在不同翻译延伸因子突变性腺中的表达模式存在差异，其表达水平受到不同翻译延伸因子突变的影响。核糖体蛋白基因可能通过异常活跃上调其表达水平以补偿翻译延伸因子基因突变造成的功能缺陷，从而保障蛋白质合成的持续性和稳定性。
综上所述，脊椎动物核糖体蛋白基因的数量在经过2R和3R后变化不大，而在真骨鱼类经过4R后显著扩张。核糖体蛋白基因在部分硬骨鱼类基因组中的分布规律是高度保守的，这些核糖体蛋白基因排列顺序的差异能反映出不同总目分类阶元鱼类的亲缘关系。首次在尼罗罗非鱼中鉴定出92个核糖体蛋白基因，并发现RPS19是鲈形总目鱼类谱系特异性复制基因。核糖体蛋白基因广泛参与到各种组织细胞的生理生化过程中，其表达水平反映出组织的不同代谢活性。核糖体蛋白基因在性腺中的表达模式与性类固醇合成酶基因的表达模式基本一致，其表达水平与性类固醇激素合成水平呈正相关。核糖体蛋白基因在不同抑制剂处理和不同翻译延伸因子突变性腺中的表达模式存在差异，其表达水平受到抑制剂处理和翻译延伸因子基因突变的影响。这些结果表明，硬骨鱼类蛋白质生物合成的翻译机器——核糖体蛋白基因的表达模式并非一成不变的，而是随着细胞需求及蛋白质生物合成的种类和数量的需求变化而变化。本研究丰富了核糖体蛋白基因在脊椎动物中的系统演化和表达认知，尤其是为其在硬骨鱼类正常和非正常生长发育过程中的功能研究提供了新的视角。
1)脊椎动物核糖体蛋白基因的鉴定及基因组定位
在海鞘(Ciona intestinalis)、七鳃鳗(Petromyzon marinus)、腔棘鱼(Latimeria chalumnae)、人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、斑点雀鳝(Lepisosteus oculatus)、斑马鱼(Danio rerio)、鲤鱼(Cyprinus carpio)、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、大西洋鲑(Salmo salar)、青鳉(Oryzias latipes)、尼罗罗非鱼和红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)共13种代表动物的基因组中分别发现了79、64、86、84、83、80、85、125、90、148、88、92和86个核糖体蛋白基因。脊椎动物核糖体蛋白基因的数量在经过第二轮和第三轮基因组复制(Second and third round of genome duplication，2R and 3R)后数量变化不大，而在真骨鱼类经过第四轮基因组复制(Fourth round of genome duplication，4R)后数量显著扩张。氨基酸序列比较分析发现，尼罗罗非鱼核糖体蛋白基因与青鳉、红鳍东方鲀、斑马鱼和人的相似性分别为97%、96.5%、94.1%和92.7%，在不同物种中高度保守。基因组定位发现，尼罗罗非鱼92个核糖体蛋白基因散布在22个连锁群(linkage groups，LG)上，每个连锁群携带1个或多个基因。进一步在其它硬骨鱼类中进行基因组定位发现，部分核糖体蛋白基因在基因组上形成基因簇，这种基因分布规律在蝶形目、月鱼目、鲈形目、刺鱼目和鳉形目之间，以及在鲤形目、鲇形目和脂鲤目之间是高度保守的，表明核糖体蛋白基因在染色体上排列顺序的差异可以作为鲈形总目和骨鳔总目的鉴别分子标记，为研究分子进化提供了一条新的途径。
2)脊椎动物核糖体蛋白基因的系统进化分析
系统进化和共线性分析发现，大多数核糖体蛋白基因的复制基因在经历了2R事件后在脊椎动物演化过程中发生了丢失，但RPL3、RPL7、RPL22和RPS27经过2R后在脊椎动物中保留了下来，RPS17、RPS27、RPL5、RPL19、RPL22、RPL41和RPLP2在真骨鱼类中经过3R后保留了下来，RPS27和RPL22既经历了2R也经历了3R并保留了下来。部分基因如RPS27、RPL5、RPL7、RPL22、RPLP2在鲤鱼和大西洋鲑中甚至经历4R后被保留了下来。此外，首次在尼罗罗非鱼中发现10个核糖体蛋白具有复制基因。其中，RPS17、RPS19、RPL3、RPL5、RPL7、RPL19、RPL41和RPLP2均有2个复制基因，RPL22有3个复制基因，RPS27有4个复制基因。我们在尼罗罗非鱼中新发现RPS19的复制基因，该复制基因仅在鲈形总目的鱼类中存在，而在其它鱼类中没有发现，表明RPS19来源于鲈形总目鱼类谱系特异性复制。
3)核糖体蛋白基因在硬骨鱼类成鱼组织中的表达模式分析
基于尼罗罗非鱼成鱼8个不同组织和南方鲇(Silurus meridionalis)成鱼10个不同组织的转录组分析发现，全部核糖体蛋白基因在所有组织中均有表达，但其表达水平在不同组织中存在差异，在不同鱼类的同一组织中的表达水平也存在差异。在尼罗罗非鱼肝脏中的表达水平最高，卵巢中的表达水平最低；而在南方鲇卵巢中的表达水平最高，脾脏中的表达水平最低。在尼罗罗非鱼中，RPL38在脑、心脏、肾脏、肝脏和头肾中的表达水平最高，RPS12在卵巢、精巢和肌肉中的表达水平最高；相反，RPL3-2在脑、心脏、肾脏、肝脏、精巢和卵巢中的表达水平最低，RPS19b在肌肉和头肾中的表达水平最低。在南方鲇中，RPL39在脑、鳍条、心脏、肾脏、头肾和脾脏中的表达水平最高，RPLP1在肝脏、胰脏和精巢中的表达水平最高，RPL21在卵巢中的表达水平最高；相反，RPL3-2在所有组织中的表达水平最低。我们的qPCR验证实验结果与转录组分析结果一致。本研究结果进一步证实核糖体蛋白基因广泛参与到各种组织细胞的生理过程中，其表达水平可以随着细胞需求及蛋白质生物合成需求的变化而变化，反映出组织的不同代谢活性。
4)核糖体蛋白基因在硬骨鱼类不同发育时期性腺中的表达模式分析
本研究通过对尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、南方鲇和多鳞白甲鱼(Onychostoma macrolepis)共4种硬骨鱼类不同发育时期的性腺转录组分析发现，所有的核糖体蛋白基因在性腺中均有表达，但其表达水平在不同性别和不同发育时期的性腺中存在差异，没有发现性别或发育阶段特异性核糖体蛋白基因。核糖体蛋白基因在尼罗罗非鱼孵化后5天(days after hatch，dah)和奥利亚罗非鱼5和10dah性腺中的表达模式相似，二者都是在雌性中的表达水平高于雄性，而在其它发育时期呈现出雄性高于雌性的表达模式；在南方鲇120、360和540dah以及在多鳞白甲鱼成鱼中都呈现出雄性高于雌性的表达模式。进一步分析发现，核糖体蛋白基因的表达模式与性类固醇合成酶基因的表达模式基本一致，其表达水平与性类固醇激素合成水平呈正相关。此外，我们在尼罗罗非鱼中还发现11个核糖体蛋白基因呈现表型性别依赖型表达模式。qPCR和免疫组化验证分析表明，RPL5b在卵巢中的表达量高于精巢，而RPL24在精巢中的表达量高于卵巢，该结果与转录组分析结果一致。研究结果表明，核糖体蛋白基因在性腺中的表达模式并不是一成不变的，而是受性类固醇激素的影响，随着性腺发育过程中对于性类固醇激素合成的种类和数量的需求变化而适应调整。
5)抑制剂处理和翻译延伸因子突变罗非鱼性腺中核糖体蛋白基因的表达分析
本研究通过对芳香化酶抑制剂Fadrozole和黄体酮受体抑制剂RU486分别处理XX尼罗罗非鱼的性腺转录组分析发现，与正常XX相比，大多数核糖体蛋白基因在Fadrozole_XX和RU486_XX性腺中的表达水平上调，其中分别有6个(7%)和64个(70%)基因的表达水平显著上调，各有2个(2%)基因的表达水平显著下调。与正常XY相比，在Fadrozole_XX性腺中有90个(98%)基因的表达水平下调，其中有57个(62%)基因的表达水平显著下调，1个基因的表达水平显著上调；在RU486_XX性腺中有53个(58%)基因的表达水平上调，仅发现1个基因(RPS19b)的表达水平显著上调，1个基因(RPL38)的表达水平显著下调。研究结果表明，核糖体蛋白基因在不同抑制剂处理性腺中的表达模式存在差异，其表达水平受到抑制剂处理的影响。
本研究通过对尼罗罗非鱼eEF1A1b+/-(翻译延伸因子eEF1A1b杂合突变)精巢和42Sp50-/-(翻译延伸因子42Sp50纯合突变)卵巢的转录组分析发现，绝大多数核糖体蛋白基因的表达上调，其中有11个基因在eEF1A1b+/-精巢中的表达水平显著上调，29个基因在42Sp50-/-卵巢中的表达水平显著上调，均没有发现显著下调表达的基因。其中，RPS3、RPL18A和RPL37在eEF1A1b+/-精巢和42Sp50-/-卵巢中均显著上调。研究结果表明，核糖体蛋白基因在不同翻译延伸因子突变性腺中的表达模式存在差异，其表达水平受到不同翻译延伸因子突变的影响。核糖体蛋白基因可能通过异常活跃上调其表达水平以补偿翻译延伸因子基因突变造成的功能缺陷，从而保障蛋白质合成的持续性和稳定性。
综上所述，脊椎动物核糖体蛋白基因的数量在经过2R和3R后变化不大，而在真骨鱼类经过4R后显著扩张。核糖体蛋白基因在部分硬骨鱼类基因组中的分布规律是高度保守的，这些核糖体蛋白基因排列顺序的差异能反映出不同总目分类阶元鱼类的亲缘关系。首次在尼罗罗非鱼中鉴定出92个核糖体蛋白基因，并发现RPS19是鲈形总目鱼类谱系特异性复制基因。核糖体蛋白基因广泛参与到各种组织细胞的生理生化过程中，其表达水平反映出组织的不同代谢活性。核糖体蛋白基因在性腺中的表达模式与性类固醇合成酶基因的表达模式基本一致，其表达水平与性类固醇激素合成水平呈正相关。核糖体蛋白基因在不同抑制剂处理和不同翻译延伸因子突变性腺中的表达模式存在差异，其表达水平受到抑制剂处理和翻译延伸因子基因突变的影响。这些结果表明，硬骨鱼类蛋白质生物合成的翻译机器——核糖体蛋白基因的表达模式并非一成不变的，而是随着细胞需求及蛋白质生物合成的种类和数量的需求变化而变化。本研究丰富了核糖体蛋白基因在脊椎动物中的系统演化和表达认知，尤其是为其在硬骨鱼类正常和非正常生长发育过程中的功能研究提供了新的视角。