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骨架蛋白CUL4B作为Cullin家族的一员，参与构成Cullin4B-RINGE3泛素连接酶复合物(Cullin 4B-RING E3 ligases，CRL4Bs)，通过多泛素化修饰底物蛋白介导蛋白降解和单泛素化H2AK119并协同多种转录抑制复合物发挥表观调控作用。2007年英国研究小组和本课题组先后发现CUL4B基因突变导致X连锁智力低下综合征，随后陆续有研究证实CUL4B基因突变是X连锁智力低下综合征的最常见的三个病因之一。分析已报道的CUL4B突变患者临床表型发现，智力低下、身材矮小、失语和癫痫是CUL4B突变患者最常见的临床表现。利用基因敲除小鼠模型研究发现，中枢神经系统缺失CUL4B的小鼠表现为学习记忆能力低下、海马中PV-阳性GABA能中间神经元数量减少、海马神经元树突分支减少、胞体减小、树突棘密度和形态异常等，但目前关于CUL4B突变引起智力低下等表型的机制尚不清楚。
诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是一类由终末分化细胞重编程得到的具有自我更新和多向分化潜能的胚胎干细胞样细胞，具有供体细胞来源丰富、可大量扩增并定向分化为各种功能细胞等优点。自iPSCs技术问世以来，患者突变特异性iPSCs及其定向分化细胞模型被用于各种遗传性疾病研究，尤其是神经发育和神经退行性疾病，因为这类疾病的病变组织获取困难，加之人类中枢神经系统结构复杂精细，小鼠等动物模型不能很好地再现人类疾病的病理特征。
为研究CUL4B丧失功能突变导致X连锁智力低下综合征的发生机制，本课题拟通过构建CUL4B突变特异性iPSCs模型，分析CUL4B缺失对iPSCs产生、iPSCs增殖以及由iPSCs诱导形成的神经祖细胞的影响，为理解CUL4B突变致病机制奠定基础。
第一部分CUL4B缺失型小鼠诱导多能干细胞模型构建及其初步应用
尽管许多研究显示CUL4B突变是导致X连锁智力低下综合征的三个主要致病原因之一，基因敲除小鼠模型也证实缺失Cul4b的小鼠表现为学习记忆能力障碍，但目前关于CUL4B突变导致X连锁智力低下综合征认知障碍的机制尚不清楚。iPSCs是研究遗传性疾病尤其是神经发育疾病发病机制的良好平台。因此，本课题拟建立CUL4B突变特异性iPSCs模型，并探讨其在研究CUL4B突变引起的智力低下综合征发生机制中的作用。
研究显示表观遗传修饰改变会影响体细胞重编程，CUL4B复合物可以通过催化组蛋白H2AK119单泛素化进而改变多种转录抑制复合物在特定基因启动子区域的结合状态。因此，我们推测CUL4B丧失功能突变可能会影响体细胞重编程效率。为此，本研究的第一部分我们首先分析了缺失CUL4B对小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast cells，MEFs)重编程及其产生的miPSCs功能的影响，取得了如下结果:
1.通过将Cul4bfn/fn雌鼠与Sox2-Cre+/-雄鼠进行交配，获得缺失CUL4B和对照MEFs;EdU掺入实验显示缺失CUL4B的MEFs存在增殖缺陷。
2.将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种转录因子转入对照和Cul4b敲除的MEFs，诱导得到两种基因型的miPSCs。
3.对miPSCs进行特性鉴定:
1)多能干细胞标志物分析:免疫荧光染色检测OCT4、SOX2和SSEA1的表达情况，发现诱导得到的miPSCs均有表达;Real-timeqPCR检测发现内源多能性基因被激活，而外源多能性基因被沉默;
2)三胚层分化潜能分析:多能干细胞的重要特性是能分化成多种功能细胞。为分析CUL4B缺失是否影响iPSCs分化潜力，我们采用体外和体内分析方法分析了两种基因型miPSCs的三胚层分化潜力。发现两种基因型miPSCs分化形成的组织中可以检测到内胚层、中胚层和外胚层特异性标志物表达;
3)核型分析显示，缺失CUL4B和对照miPSC均显示正常核型。
4.发现缺失CUL4B增加MEFs重编程效率:将相同数目的野生型和Cul4b敲除的MEFs分别进行诱导，9天后进行碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)染色，发现Cul4b敲除的细胞形成的AP阳性克隆数目明显高于野生型;RT-qPCR和WesternBlot显示CUL4B缺失导致内源Nanog基因表达升高，说明CUL4B在miPSCs的重编程过程中起到抑制作用。
5.发现CUL4B通过调控E-Cadherin表达而调控MEFs重编程:
1)利用WesternBlot分析已知的调控体细胞重编程的信号通路分子表达情况发现，缺失CUL4B不影响Wnt通路、BMP通路和H3K9me3;但显著上调E-Cadherin蛋白和mRNA表达;
2)进一步分析发现，过表达CUL4B导致E-Cadherin表达下调、重编程效率降低，说明CUL4B负向调控E-Cadherin的表达，且CUL4B在重编程过程中起抑制作用;
3)为证实CUL4B调控MEFs重编程是通过调控E-Cadherin表达介导的，我们在Cul4b敲除的MEFs中敲低Cdh1，使其E-Cadherin降到与野生型相似水平，发现敲低Cdh1基因，可以拯救由于缺失CUL4B引起的重编程效率上调，证实CUL4B调控重编程是通过调控E-Cadherin表达实现的;
4)为分析CUL4B调控Cdh1基因表达机制，我们采用ChIP实验分析了CUL4B复合物在Cdh1基因启动子区域结合情况，发现CUL4B及其复合物组份DDB1和催化产物H2AK119ub1均可以结合到Cdh1的启动子上，而且敲除CUL4B减少其催化产物H2AK119ub1和相互作用复合物PRC2催化产物H3K27me3在Cdh1的启动子上的富集程度。说明CUL4B复合物通过催化H2AK119ub1而抑制Cdh1基因转录。
6.发现缺失CUL4B抑制miPSCs增殖:利用EdU掺入实验检测miPSCs的增殖，发现Cul4b敲除的miPSCs增殖率明显降低;将野生型和Cul4b敲除的miPSCs等比例混合培养，发现Cul4b敲除的miPSCs数量逐渐减少，并很快消失;细胞周期分析显示敲除Cul4b导致G1期阻滞;蛋白分析显示缺失CUL4B导致p21上调。
7.将miPSCs诱导分化成神经祖细胞(neural progenitor cells，NPCs)，并进行鉴定;利用EdU掺入实验检测野生型和Cul4b敲除的NPCs增殖率，发现CUL4B缺失会导致NPCs增殖能力下降;流式检测细胞周期发现CUL4B缺失导致NPCsG1期阻滞，同时伴随着p21累积。
8.诱导NPCs向神经元和神经胶质细胞分化，发现CUL4B缺失导致NPCs向神经元分化减少，且神经元轴突分支减少，NPCs的NOTCH1表达升高。当加入Notch通路的抑制剂DAPT时，可以拯救由于CUL4B缺失导致的神经元分化比例减少。说明CUL4B缺失使Notch通路异常活化，阻碍神经元的分化。
综上所述，我们利用经典四因子方法成功将Cul4b敲除和对照MEFs诱导成为miPSCs，且在体内和体外均具有三胚层分化能力。CUL4B通过结合到Cdh1的启动子上，发挥转录抑制功能，进而降低E-Cadherin的表达，阻碍重编程的进程。CUL4B缺失导致miPSCs和诱导的NPCs在G1期阻滞，增殖能力下降，并异常活化Notch通路，从而阻碍NPCs向神经元分化。
第二部分CUL4B丧失功能突变患者及对照个体iPSCs模型构建及其初步分析
为构建CUL4B丧失功能突变患者iPSCs模型，我们对前期研究发现的两个CUL4B突变家系患者进行了分析，其中患者1的突变为c.1564C＞T,p.R388X，患者2的突变为c.1007_1011del,p.Ile336fs。通过采集患者和对照个体体细胞，经过重编程获得hiPSCs，并对hiPSC进行特性鉴定和功能分析，取得了以下结果:
1.构建了2种不同突变患者和2名对照个体iPSCs:从2名患者和1名对照个体采集外周血，分离单个核细胞;从1名对照个体获得尿液细胞;采用非整合质粒转染方法获得了患者和对照个体hiPSCs;
2.hiPSCs特性鉴定:对获得的hiPSCs，从以下方面进行了特性分析:
1)采用免疫荧光染色和RT-qPCR分析方法检测了多能性基因表达情况，结果显示hiPSCs高表达多能性蛋白标志物OCT4、SOX2、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81;内源的OCT4、SOX2和NANOG表达量均达到与胚胎干细胞H9相同的水平。
2)三胚层定向诱导分化分析显示，来自患者和对照个体的hiPSCs可以向三胚层分化;
3)外源基因表达检测:对10代以上的hiPSCs提取基因组DNA，用外源基因特异性引物进行PCR扩增，未检测到外源基因表达;
4)核型及STR位点分析:核型分析发现hiPSCs构建过程中并没有发生染色体畸变;STR位点分析表明hiPSCs来源于对应患者的PBMCs，没有其他细胞污染;
5)CUL4B突变和表达分析:对两名患者来源hiPSCs进行CUL4B基因测序分析，发现获得的hiPSCs具有与来源细胞相同的基因突变;且不表达CUL4B蛋白，CUL4B的mRNA水平也显著降低，说明两种CUL4B突变均引起无义突变介导的mRNA降解。
3.将hiPSCs诱导分化为NPCs，并通过免疫荧光检测SOX2、NESTIN和PAX6的表达，确定分化的NPCs纯度较高。
4.CUL4B突变对NPCs增殖的影响:EdU掺入实验检测显示CUL4B突变患者来源的NPCs增殖能力显著下降。
5.CUL4B突变对NPCs迁移的影响:为分析CUL4B突变对NPCs迁移的影响，我们进行划痕实验，结果显示CUL4B突变患者来源的NPCs迁移能力显著降低。
6.NPCs分化能力检测:将NPCs向神经元分化，免疫荧光染色显示CUL4B突变患者来源的NPCs向成熟神经元的分化减少，向GABA能神经元分化减少。
7.转录组分析:将正常人和患者来源的NPCs进行RNA-Seq分析，共检测出2075个差异基因。为缩小范围，我们将筛选条件定为2倍以上差异，且Q-Value＜0.01，由此我们得到上调基因31个，下调基因116个。
1)分别对上调基因和下调基因进行GO-cfp分类分析，发现其生物学分类大致相同，但在下调基因中有与迁移和增殖相关的基因。分别对迁移相关基因和增殖相关基因进行聚类分析和表达验证，在迁移相关基因中，患者来源的NPCs的SEMA6D、ONECUT2和RHOD表达量明显下降;在增殖相关基因中，TBX3、CTHRC1、PRRX1表达量明显下降;
2)对患者来源NPCs中下调基因进行了KEGG-pathway富集分析，发现其中有GABA能突触相关的基因。对这几个基因进行聚类热图分析以及qPCR验证，发现相关的三个基因GABRE、CACNA1A和PRCKB在患者来源的NPCs中均明显下调，与我们观察到的CUL4B突变导致GABA能神经元分化减少表型一致。
综上所述，我们成功构建了两例CUL4B突变患者的hiPSCs细胞系，并将其分化成NPCs，发现其增殖减慢、迁移能力下降、向GABA能神经元分化减少。通过RNA-Seq分析，发现与增殖、迁移及GABA能神经元分化相关基因表达差异，提示我们患者来源的NPCs可能由于这些基因的下调导致其一系列表型的出现，具体机制有待进一步分析。
诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是一类由终末分化细胞重编程得到的具有自我更新和多向分化潜能的胚胎干细胞样细胞，具有供体细胞来源丰富、可大量扩增并定向分化为各种功能细胞等优点。自iPSCs技术问世以来，患者突变特异性iPSCs及其定向分化细胞模型被用于各种遗传性疾病研究，尤其是神经发育和神经退行性疾病，因为这类疾病的病变组织获取困难，加之人类中枢神经系统结构复杂精细，小鼠等动物模型不能很好地再现人类疾病的病理特征。
为研究CUL4B丧失功能突变导致X连锁智力低下综合征的发生机制，本课题拟通过构建CUL4B突变特异性iPSCs模型，分析CUL4B缺失对iPSCs产生、iPSCs增殖以及由iPSCs诱导形成的神经祖细胞的影响，为理解CUL4B突变致病机制奠定基础。
第一部分CUL4B缺失型小鼠诱导多能干细胞模型构建及其初步应用
尽管许多研究显示CUL4B突变是导致X连锁智力低下综合征的三个主要致病原因之一，基因敲除小鼠模型也证实缺失Cul4b的小鼠表现为学习记忆能力障碍，但目前关于CUL4B突变导致X连锁智力低下综合征认知障碍的机制尚不清楚。iPSCs是研究遗传性疾病尤其是神经发育疾病发病机制的良好平台。因此，本课题拟建立CUL4B突变特异性iPSCs模型，并探讨其在研究CUL4B突变引起的智力低下综合征发生机制中的作用。
研究显示表观遗传修饰改变会影响体细胞重编程，CUL4B复合物可以通过催化组蛋白H2AK119单泛素化进而改变多种转录抑制复合物在特定基因启动子区域的结合状态。因此，我们推测CUL4B丧失功能突变可能会影响体细胞重编程效率。为此，本研究的第一部分我们首先分析了缺失CUL4B对小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast cells，MEFs)重编程及其产生的miPSCs功能的影响，取得了如下结果:
1.通过将Cul4bfn/fn雌鼠与Sox2-Cre+/-雄鼠进行交配，获得缺失CUL4B和对照MEFs;EdU掺入实验显示缺失CUL4B的MEFs存在增殖缺陷。
2.将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种转录因子转入对照和Cul4b敲除的MEFs，诱导得到两种基因型的miPSCs。
3.对miPSCs进行特性鉴定:
1)多能干细胞标志物分析:免疫荧光染色检测OCT4、SOX2和SSEA1的表达情况，发现诱导得到的miPSCs均有表达;Real-timeqPCR检测发现内源多能性基因被激活，而外源多能性基因被沉默;
2)三胚层分化潜能分析:多能干细胞的重要特性是能分化成多种功能细胞。为分析CUL4B缺失是否影响iPSCs分化潜力，我们采用体外和体内分析方法分析了两种基因型miPSCs的三胚层分化潜力。发现两种基因型miPSCs分化形成的组织中可以检测到内胚层、中胚层和外胚层特异性标志物表达;
3)核型分析显示，缺失CUL4B和对照miPSC均显示正常核型。
4.发现缺失CUL4B增加MEFs重编程效率:将相同数目的野生型和Cul4b敲除的MEFs分别进行诱导，9天后进行碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)染色，发现Cul4b敲除的细胞形成的AP阳性克隆数目明显高于野生型;RT-qPCR和WesternBlot显示CUL4B缺失导致内源Nanog基因表达升高，说明CUL4B在miPSCs的重编程过程中起到抑制作用。
5.发现CUL4B通过调控E-Cadherin表达而调控MEFs重编程:
1)利用WesternBlot分析已知的调控体细胞重编程的信号通路分子表达情况发现，缺失CUL4B不影响Wnt通路、BMP通路和H3K9me3;但显著上调E-Cadherin蛋白和mRNA表达;
2)进一步分析发现，过表达CUL4B导致E-Cadherin表达下调、重编程效率降低，说明CUL4B负向调控E-Cadherin的表达，且CUL4B在重编程过程中起抑制作用;
3)为证实CUL4B调控MEFs重编程是通过调控E-Cadherin表达介导的，我们在Cul4b敲除的MEFs中敲低Cdh1，使其E-Cadherin降到与野生型相似水平，发现敲低Cdh1基因，可以拯救由于缺失CUL4B引起的重编程效率上调，证实CUL4B调控重编程是通过调控E-Cadherin表达实现的;
4)为分析CUL4B调控Cdh1基因表达机制，我们采用ChIP实验分析了CUL4B复合物在Cdh1基因启动子区域结合情况，发现CUL4B及其复合物组份DDB1和催化产物H2AK119ub1均可以结合到Cdh1的启动子上，而且敲除CUL4B减少其催化产物H2AK119ub1和相互作用复合物PRC2催化产物H3K27me3在Cdh1的启动子上的富集程度。说明CUL4B复合物通过催化H2AK119ub1而抑制Cdh1基因转录。
6.发现缺失CUL4B抑制miPSCs增殖:利用EdU掺入实验检测miPSCs的增殖，发现Cul4b敲除的miPSCs增殖率明显降低;将野生型和Cul4b敲除的miPSCs等比例混合培养，发现Cul4b敲除的miPSCs数量逐渐减少，并很快消失;细胞周期分析显示敲除Cul4b导致G1期阻滞;蛋白分析显示缺失CUL4B导致p21上调。
7.将miPSCs诱导分化成神经祖细胞(neural progenitor cells，NPCs)，并进行鉴定;利用EdU掺入实验检测野生型和Cul4b敲除的NPCs增殖率，发现CUL4B缺失会导致NPCs增殖能力下降;流式检测细胞周期发现CUL4B缺失导致NPCsG1期阻滞，同时伴随着p21累积。
8.诱导NPCs向神经元和神经胶质细胞分化，发现CUL4B缺失导致NPCs向神经元分化减少，且神经元轴突分支减少，NPCs的NOTCH1表达升高。当加入Notch通路的抑制剂DAPT时，可以拯救由于CUL4B缺失导致的神经元分化比例减少。说明CUL4B缺失使Notch通路异常活化，阻碍神经元的分化。
综上所述，我们利用经典四因子方法成功将Cul4b敲除和对照MEFs诱导成为miPSCs，且在体内和体外均具有三胚层分化能力。CUL4B通过结合到Cdh1的启动子上，发挥转录抑制功能，进而降低E-Cadherin的表达，阻碍重编程的进程。CUL4B缺失导致miPSCs和诱导的NPCs在G1期阻滞，增殖能力下降，并异常活化Notch通路，从而阻碍NPCs向神经元分化。
第二部分CUL4B丧失功能突变患者及对照个体iPSCs模型构建及其初步分析
为构建CUL4B丧失功能突变患者iPSCs模型，我们对前期研究发现的两个CUL4B突变家系患者进行了分析，其中患者1的突变为c.1564C＞T,p.R388X，患者2的突变为c.1007_1011del,p.Ile336fs。通过采集患者和对照个体体细胞，经过重编程获得hiPSCs，并对hiPSC进行特性鉴定和功能分析，取得了以下结果:
1.构建了2种不同突变患者和2名对照个体iPSCs:从2名患者和1名对照个体采集外周血，分离单个核细胞;从1名对照个体获得尿液细胞;采用非整合质粒转染方法获得了患者和对照个体hiPSCs;
2.hiPSCs特性鉴定:对获得的hiPSCs，从以下方面进行了特性分析:
1)采用免疫荧光染色和RT-qPCR分析方法检测了多能性基因表达情况，结果显示hiPSCs高表达多能性蛋白标志物OCT4、SOX2、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81;内源的OCT4、SOX2和NANOG表达量均达到与胚胎干细胞H9相同的水平。
2)三胚层定向诱导分化分析显示，来自患者和对照个体的hiPSCs可以向三胚层分化;
3)外源基因表达检测:对10代以上的hiPSCs提取基因组DNA，用外源基因特异性引物进行PCR扩增，未检测到外源基因表达;
4)核型及STR位点分析:核型分析发现hiPSCs构建过程中并没有发生染色体畸变;STR位点分析表明hiPSCs来源于对应患者的PBMCs，没有其他细胞污染;
5)CUL4B突变和表达分析:对两名患者来源hiPSCs进行CUL4B基因测序分析，发现获得的hiPSCs具有与来源细胞相同的基因突变;且不表达CUL4B蛋白，CUL4B的mRNA水平也显著降低，说明两种CUL4B突变均引起无义突变介导的mRNA降解。
3.将hiPSCs诱导分化为NPCs，并通过免疫荧光检测SOX2、NESTIN和PAX6的表达，确定分化的NPCs纯度较高。
4.CUL4B突变对NPCs增殖的影响:EdU掺入实验检测显示CUL4B突变患者来源的NPCs增殖能力显著下降。
5.CUL4B突变对NPCs迁移的影响:为分析CUL4B突变对NPCs迁移的影响，我们进行划痕实验，结果显示CUL4B突变患者来源的NPCs迁移能力显著降低。
6.NPCs分化能力检测:将NPCs向神经元分化，免疫荧光染色显示CUL4B突变患者来源的NPCs向成熟神经元的分化减少，向GABA能神经元分化减少。
7.转录组分析:将正常人和患者来源的NPCs进行RNA-Seq分析，共检测出2075个差异基因。为缩小范围，我们将筛选条件定为2倍以上差异，且Q-Value＜0.01，由此我们得到上调基因31个，下调基因116个。
1)分别对上调基因和下调基因进行GO-cfp分类分析，发现其生物学分类大致相同，但在下调基因中有与迁移和增殖相关的基因。分别对迁移相关基因和增殖相关基因进行聚类分析和表达验证，在迁移相关基因中，患者来源的NPCs的SEMA6D、ONECUT2和RHOD表达量明显下降;在增殖相关基因中，TBX3、CTHRC1、PRRX1表达量明显下降;
2)对患者来源NPCs中下调基因进行了KEGG-pathway富集分析，发现其中有GABA能突触相关的基因。对这几个基因进行聚类热图分析以及qPCR验证，发现相关的三个基因GABRE、CACNA1A和PRCKB在患者来源的NPCs中均明显下调，与我们观察到的CUL4B突变导致GABA能神经元分化减少表型一致。
综上所述，我们成功构建了两例CUL4B突变患者的hiPSCs细胞系，并将其分化成NPCs，发现其增殖减慢、迁移能力下降、向GABA能神经元分化减少。通过RNA-Seq分析，发现与增殖、迁移及GABA能神经元分化相关基因表达差异，提示我们患者来源的NPCs可能由于这些基因的下调导致其一系列表型的出现，具体机制有待进一步分析。