长链非编码RNA在脊柱转移瘤及肝细胞癌中的作用与临床意义研究

来源 :中国人民解放军军事医学科学院 | 被引量 : 1次 | 上传用户:ljh6090008
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
随着环境污染及食品安全问题日趋严重,吸烟、饮酒等不良生活习惯逐渐向年轻化发展,致使肿瘤发病率逐年增高。目前肿瘤已经成为威胁人类健康的重大疾病。我国不管发病率还是死亡率均居世界前列,给国民健康造成了极大的危害。肿瘤及其相关并发症的研究越来越被研究者们所重视。虽然近些年在肿瘤诊断方法及治疗手段上已取得长足的进步。但对于肺癌、肝癌、胰腺癌等恶性肿瘤的治疗效果、预后和远期生存率仍然较差。其主要原因归结为对肿瘤发生发展机制的认识不够深入。脊柱为肿瘤骨转移最为常见的部位,高达70%的癌症患者会发生脊柱转移。脊柱转移瘤可导致脊髓压迫及病理性骨折,使患者瘫痪,完全失去自理能力。严重影响患者的生活质量,从而加速病情的进展。至今国内外学者对肿瘤脊柱转移的机制尚不清楚,致使缺乏有效的治疗方法。因此脊柱转移瘤的治疗仍然是困扰医学界的一大难题。手术虽然能有效促进恢复,但并发症多,创伤较大且短时间内容易复发,使部分患者在术后一月内死亡。因此,探寻介导肿瘤脊柱转移的关键靶分子,是提高脊柱转移瘤病人临床疗效,改善患者预后及生存质量的新方向。部分肿瘤具有较强的嗜骨性,晚期容易发生骨转移,例如肝癌、肺癌、乳腺癌等。脊柱为肝癌骨转移最为常见的部位,发生脊柱转移患者存活率不到3%。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种全球范围内常见的恶性肿瘤,占原发性肝癌的90%以上。患者常常伴有肝内及肝外转移。HCC早期临床症状及体征多不典型,很难及早发现。明确诊断时大多病程已进入中、晚期,失去手术机会。因其恶性程度高、早期发现难、进展速度快、治疗复杂、术后复发及转移率较高等特点,使HCC患者疗效不佳,预后较差。以往对HCC研究主要以microRNA及编码蛋白的RNA为主,长链非编码RNA研究相对较少。目前国内外对HCC的分子机制研究还不够深入,因此我们需进一步对HCC在发生、发展及转移过程中的分子生物学机制进行探索。寻找可预测HCC发生的分子标志物,为HCC诊疗开辟新途径。人类基因组是由庞大且复杂的核苷酸序列排列而成。目前已知可编码蛋白的基因仅占人类基因组序列的2%,其余98%不具备编码蛋白能力的序列被认为是基因组中无用的“噪声”。这类从基因组转录而来,且不编码蛋白的RNA分子称为非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。早期,研究者仅仅对编码RNA进行关注,但近年来人们的目光逐渐被非编码RNA所吸引。随着研究的不断深入,发现长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)与人类多种疾病如阿尔茨海默症、肿瘤、亨廷顿氏病的发生、发展存在着重要的关系。LncRNA转录本长度大于200nt,且不具备蛋白编码的能力。最新研究表明,lncRNA在生命活动过程中扮演着重要角色,可通过调控mRNA和蛋白表达水平影响生物学行为。目前越来越多的肿瘤相关lncRNA得以发现,其通过多种方式调控着肿瘤的生长、转移、侵润与凋亡,成为全新肿瘤标志物及药物靶标,显著推进了肿瘤研究的进展。Ji等通过测序技术发现了肺腺癌转移相关转录本(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT 1),对225例Ⅲ期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者进行筛查。发现70例转移患者的样本中MALAT1过表达,且具有病程及组织特异性。提示MALAT 1可作为Ⅰ期NSCLC患者潜在标志物。该基因在其他肿瘤中也陆续被发现,但在NSCLC患者中的表达最为显著。MALAT 1可通过激活肿瘤转移相关基因来促进肿瘤转移,还可参与mRNA前体的可变剪切和丝氨酸/精氨酸剪接因子的磷酸化修饰,来影响基因的功能及表达。随着对肿瘤基因组学及转录组学研究的不断深入,研究者发现不但同种肿瘤中可存在不同的lncRNA,而且同一lncRNA也可在不同肿瘤中差异表达。HULC最早发现在肝癌细胞中过表达,可作为原发性肝癌较为敏感的分子标志物,其在前列腺癌、胃癌中也出现异常表达情况。H19作为一个原癌基因,在多种消化系统肿瘤中表达量升高。综上所述,lncRNA在肿瘤学研究中发挥着至关重要的作用。目前,脊柱转移瘤患者多采取微创治疗方案,脊柱后路开放式手术相对较少。因此组织样本较为珍贵,收集相对困难,且骨组织RNA较难提取。致使国内外对于lncRNA在脊柱转移瘤中的研究尚处空白。LncRNA在HCC中的研究仍然较少,并且绝大多数lncRNA调控机制尚不明确。由此提示我们,是否可以通过高通量测序技术进行筛选及验证,找到全新的关键lncRNA作为肿瘤诊断及治疗靶标,为脊柱转移瘤和HCC临床诊疗提供新策略。基于此我们开展了以下三部分研究,现总结如下。第一章:脊柱转移瘤转录组lncRNA表达谱分析目的:建立脊柱转移瘤差异表达lncRNA及mRNA表达谱,并对其长度及外显子数量进行预测。明确差异表达mRNA可富集的分子功能、生物学过程和疾病通路相关信息。方法:对脊柱转移瘤患者配对组织(肿瘤组织及癌旁组织)中RNA进行提取,利用高通量测序技术构建脊柱转移瘤中差异表达lncRNA及mRNA表达谱。随后通过pathway分析及GO分析对差异表达mRNA的分子功能、参与生物学过程及疾病通路进行富集。最后对差异表达lncRNA长度及外显子数目进行预测,并通过对比与编码基因间位置关系,将差异表达lncRNA分类。结果:通过高通量测序技术,在脊柱转移瘤组织中找到171条差异表达lncRNA和2929条差异表达mRNA,其中有66条全新未被报道的lncRNA。对差异表达mRNA进行pathway分析和GO分析。结果显示,脊柱转移瘤中差异表达的mRNA可富集到31种疾病,79种通路及1535种分子功能,其中包括肿瘤相关疾病及肿瘤相关通路。进一步明确了脊柱转移瘤中异常表达mRNA参与的分子功能、生物学过程和对疾病通路的调节。171条差异表达lncRNA中,大部分外显子数目小于5个,长度小于10000nt,均少于mRNA。其中Antisense共有50条,已知的19条,未知的31条;Sence共有53条,已知的51条,未知的2条;Bidirectionsl共有6条,已知的4条,未知的2条;Intergenic共有40条,已知的20条,未知的20条;Intronic共有22条,已知的8条,未知的14条。结论:成功构建了脊柱转移瘤lncRNA、mRNA表达谱。在171条差异表达lncRNA中发现66条全新未被报道的lncRNA。明确了2929条差异表达mRNA参与的分子功能、生物学过程和对疾病通路的调节。为肿瘤学研究及后续实验提供了宝贵的数据资源。第二章:lnc000489在脊柱转移瘤患者血浆中的表达及临床特征相关性分析目的:通过在血浆中验证,找出脊柱转移瘤患者血浆中高表达的lncRNA。了解其分子功能、生物学过程和疾病通路相关信息。明确其在脊柱转移瘤中的诊断价值。方法:从前期构建的脊柱转移瘤lncRNA表达谱中挑选20条全新的lncRNA。将脊柱转移瘤患者血浆设为实验组,健康志愿者血浆设为对照组。通过qRT-PCR实验检测候选lncRNA在血浆中表达量,统计分析后找出在脊柱转移瘤中具有显著差异的lncRNA。利用ROC曲线计算灵敏度和特异性。随后对差异表达lncRNA进行共表达分析,并对共表达mRNA进行pathway和GO分析。最后统计分析差异表达lncRNA与临床特征间的相关性。结果:脊柱转移瘤患者血浆中lnc00489表达量相对于健康志愿者显著升高(P<0.05),ROC曲线分析显示lnc00489对脊柱转移瘤具有一定的诊断价值。与lnc00489存在共表达关系的mRNA共有51条,可富集到实体肿瘤、卵巢癌、口腔癌、前列腺癌等多种肿瘤相关疾病和Wnt、Hh、Hedgehog signaling pathway、Basal cell carcinoma等肿瘤相关通路,进一步说明了lnc00489可能与肿瘤的发生、发展及转移存在相关性。Lnc00489表达量与临床特征进行相关性分析,显示lnc00489与转移椎体个数及是否伴有内脏转移显著相关。转移椎体数量越多病情相对严重。肿瘤主要的转移途径为血运转移,内脏及椎体血供相对丰富。综上所述lnc00489可能在肿瘤脊柱转移的过程中发挥着重要作用,其有望成为潜在的血浆标志物,为脊柱转移瘤的诊断及治疗提供了新思路。结论:Lnc00489表达量在脊柱转移瘤患者血浆中显著升高,对脊柱转移瘤具有一定的诊断价值。与lnc00489共表达的mRNA可富集到多种肿瘤相关疾病和通路。血浆中lnc00489表达量与转移椎体数量和是否伴有内脏转移具有相关性,其有望成为诊断脊柱转移瘤全新的血浆分子标志物。第三章:lnc34822在HCC患者血浆中表达及临床特征相关性研究目的:从构建的lncRNA数据库中找到一条在HCC中差异表达的lncRNA,明确其在HCC中的诊断价值。方法:利用前期建立的lncRNA数据库,结合相关文献调研筛选出10条高表达lncRNA。通过在HCC患者组织及血浆中验证,明确是否存在高表达的lncRNA。ROC曲线分析计算诊断灵敏度和特异性。利用qRT-PCR实验检测候选lncRNA在组织、血浆及细胞系(Hep3B、HepG-2、SMMC-7721、Huh7.5、LO2)中表达量。统计分析差异表达lncRNA在血浆中的稳定性,与外周血细胞间关系,不同细胞系中表达情况,在HCC患者术前、术后及复发时表达量的变化情况和与临床特征间的相关性。结果:有报道称,同种lncRNA可在不同肿瘤中进行调控,同种肿瘤也可受到多种不同lncRNA的影响。结合文献调研从构建的脊柱转移瘤lncRNA表达谱中筛选出10条高表达lncRNA。经过在HCC患者组织及血浆中验证后,发现lnc34822在HCC中表达量显著上调(P<0.01),并且可以在血浆中稳定表达。Lnc34822在肝癌细胞系中表达量明显高于正常肝细胞系,且与外周血细胞没有相关性。ROC曲线分析显示,lnc34822对HCC具有一定的诊断价值。Lnc34822在HCC患者术后血浆中表达量明显降低,而复发时又迅速升高,由此推断lnc34822有望成为一个动态监测HCC患者病情进展的血浆标志物。通过与临床信息相关性分析发现lnc34822血浆中表达量与AFP及肝上肿瘤个数呈正相关。肝癌患者血液中AFP含量显著升高,目前已成为临床上广泛应用的肿瘤标志物。肝上肿瘤数量越多病情越严重。进一步说明了lnc34822有望成为HCC潜在的血浆诊断标志物。结论:Lnc34822在HCC患者血浆中稳定高表达,且与外周血细胞没有相关性,对HCC具有一定的诊断价值。血浆中lnc34822表达量可动态监测HCC患者病情进展,其有望成为诊断HCC全新的血浆分子标志物。通过以上研究,我们成功构建了全新lncRNA数据库,为肿瘤学研究提供了宝贵的数据资源。并从中找到与脊柱转移瘤和HCC发生、发展相关的lncRNA,为脊柱转移瘤和HCC临床诊断及治疗提供了新思路。
其他文献
[目的]侵袭转移是恶性肿瘤的主要特征之一,是导致恶性肿瘤患者死亡的首要因素。近年来研究发现,趋化因子及其受体在肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移过程中起关键作用。我们前期研
实验目的腺苷酸活化蛋白激酶相关激酶5(ARK5)在包括肝细胞肝癌(HCC)在内的多种肿瘤内均高表达。肿瘤细胞内ARK5高表达的病人的预后较差。ARK5可以促进肿瘤的增殖,侵袭,迁移,
传染病模型可以用来描述某些疾病在人与动物之间的传播,预测疾病传播的强度以及提出有效的控制措施。随着新型病原体的出现,一些学者利用许多新的数学模型来解释这些病原体对
教法与学法的和谐统一是教学的最佳境界。笔者在多年的教学生涯中,注重学法的指导,教法与学法指导的有机结合,在指导学生学会学习、学会思考、学会知识的综合与运用方面不断思考
随着关系营销和零售行业品牌化的逐步发展,越来越多的企业开始认识到,要获得持续稳定的发展,就必须重视和强调对顾客的维持和保留。但是,服务是无形的,顾客又是主观的,具有差
在自主研发的小功率微波等离子体化学气相沉积(MPCVD)装置上利用高温高压(HPHT)单晶金刚石片为衬底进行了金刚石同质外延生长的研究。研究了甲烷浓度、工作气压对金刚石生长
[摘要] 目的 研究早产极低出生体重 (VLBW)儿接受早期滴服喂养的效果及其发生相关并发症的情况,探讨早期滴服喂养的临床应用价值。方法 2008年1月~2010年7月慈溪人民医院儿科收治的49例早产极低出生体重儿,分为对照组(早期鼻胃管喂养组)24例,观察组(早期滴服喂养组)25例,研究两组不同喂养方式的喂养效果及其发生相关并发症的情况。结果 与对照组比较,观察组婴儿体重增长速度(P<0.05)