背景:角膜位于眼球前壁,是一层透明的薄膜,统分为3层,从外向内依次为上皮细胞层、基质层和内皮细胞层,约占角膜全厚90%的角膜基质层位于中部。传统观点认为角膜基质层的结构排布与维持角膜的透明性关系密切。富含胶原的细胞外基质和分散在其中的基质细胞构成基质层主要结构,也有报道称基质细胞被观察到以相互联系的突起连接成网状结构。骨髓来源的单核细胞和树突状细胞亦存在于基质层。据以往文献描述,角膜神经来源于三叉神经节眼支,其在角膜基质中的分布呈由外向内的树枝状,基底下神经丛则以旋涡状分布,并且发出无数细小分支(神经末梢)至角膜上皮层。神经内分泌细胞(neuroendocrine cells,NECs)是一类有神经调质、神经递质或神经肽类激素产物的细胞,早期是在中枢神经、胃肠道和胰腺中发现的,被认为与肿瘤的发生及发展密切相关。目的:我们利用GFP大鼠角膜去除角膜上皮层后,直观观察角膜基质层细胞的形态结构,随后采用免疫荧光染色探究基质层中一类特殊细胞的类型、来源和利用CaMK2α-cre/mTmGF/-小鼠模型研究其与角膜神经的关系,以及建立GFP大鼠Alloxan眼前房注射动物模型来研究这类细胞的损伤对角膜的影响。方法:本课题实验分为四个部分,第一部分为研究角膜基质中的细胞形态和结构,采用dispaseⅡ酶解法制备GFP大鼠的去上皮角膜基质平铺片,对角膜基质进行直观的共聚焦荧光显微镜观察;第二部分是探究角膜基质中此种细胞的类型,用神经结构相关的标志(markers)和神经内分泌细胞相关的markers对GFP大鼠的去上皮角膜基质平铺片进行免疫荧光染色,并对比胰腺冰冻切片的免疫荧光染色结果;第三部分是探究角膜基质中此种细胞与角膜神经的关系,方法一是比较GFP大鼠去上皮角膜基质平铺片和三叉神经冰冻切片的免疫荧光染色结果,方法二是利用CaMK2α-cre/mTmGF/-小鼠模型的全角膜平铺片进行观察分析;第四部分是用GFP大鼠Alloxan眼前房注射动物模型探索此种细胞的损伤对角膜的影响。本实验分为2组:Normal组和Alloxan组,每组大鼠6只,Alloxan组按前房注射完成时间分为P1、P7、P60,每个时间点各两只。结果:第一部分:在对GFP大鼠的角膜基质中细胞进行观察之后,我们发现了一类不同于以往报道中描述的基质细胞类型的细胞,其与神经结构形态相似,但是其独特的胞核结构证明其并不是文献中描述的神经末梢,是一种全新的细胞类型。它们既有胞体之间的聚集,又发出突起互相联系,在角膜基质中连接成网格状;第二部分:将GFP大鼠去除上皮的角膜基质做平铺片进行免疫荧光的染色,发现其表达有神经markers基因蛋白,包括Ⅲ型β-微管蛋白(TUBB3)、神经丝轻链蛋白(NEFL)、突触小泡蛋白(SYP)、泛素羧基末端水解酶L1(UCHL1)、囊泡谷氨酸转运蛋白1(Vglut1)和钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶2(CaMK2)等,并表达有神经肽类蛋白神经肽Y(NPY)、生长抑素(SST)等,也表达内分泌激素markers基因产物,包括胰岛素(Insulin)等,这些发现证明了这类新型细胞的类型——神经内分泌细胞;第三部分:对GFP大鼠的三叉神经节冰冻切片进行免疫荧光染色,对比去上皮角膜基质平铺片免疫荧光染色,结果显示三叉神经节胞体和神经纤维皆不表达GFP(绿色荧光蛋白),但其神经相关markers、神经肽类markers和内分泌相关markers抗体染色结果皆为阳性,说明虽然三叉神经节也有神经内分泌的特性,但是角膜基质神经内分泌细胞不来源于此。通过对CaMK2α-cre/mTmGF/-小鼠模型的全角膜平铺片进行观察分析,我们发现角膜基质神经内分泌细胞并不发出到达角膜上皮的突起;第四部分:与正常组相比,Alloxan前房注射后,角膜生成永久性新生血管,角膜基质神经内分泌细胞消失,且随着时间点的延长,没有再生迹象。结论:角膜基质层中存在一种非三叉神经节来源的神经内分泌细胞,分泌神经特异性蛋白,神经肽类蛋白和胰岛素等内分泌相关蛋白,其不同于以往观点所述的角膜神经末梢,这类细胞有胞体的相互聚集,也发出长突起互相缠绕构成网格状结构,其不发出到达角膜上皮层的纤维末梢,在Alloxan对其进行特异性的损伤之后不可再生,这一损伤会诱导角膜生成永久性新生血管。这种神经内分泌细胞可能参与角膜物质代谢和新生血管形成。