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第一部分β-arrestin1延缓B-ALL细胞衰老目的:细胞衰老是指处于活性的生长状态的细胞在多种应激情况下转变为不可逆的细胞周期阻滞状态,为细胞正常生理过程中的一部分。异常衰老过程可促进肿瘤发生发展。目前,尽管急性B淋巴细胞白血病(B cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)预后明显提高,但复发B-ALL的生存率仍较低,而处于静止期的白血病起始细胞(Leukemia-initiating cells,LICs)可能是复发的根源。近年来,诱导肿瘤细胞衰老已成为肿瘤的治疗靶点之一,引起B-ALL LICs衰老的调控机制值得研究。细胞信号蛋白分子β-arrestin1为支架蛋白,可参与多条信号通路,影响正常细胞功能与肿瘤发生发展。课题组前期研究发现:β-arrestin1延缓B-ALL LICs来源的NSG小鼠骨髓细胞的衰老及端粒相关改变。本课题进一步研究β-arrestin1对B-ALL细胞衰老的作用及可能机制。方法:利用β-半乳糖苷酶染色检测B-ALL患者骨髓细胞的衰老,RT-PCR及Wetsern Blot分别检测β-arrestin1,衰老相关基因p53,p21,p27 mRNA表达及β-arrestin1蛋白表达,相关性分析β-arrestin1表达与细胞衰老的关系。利用慢病毒感染构建稳定敲低β-arrestin1的B-ALL细胞(Reh-Siβ1)及对照。利用β-半乳糖苷酶染色实验、衰老倍增时间曲线检测与探讨β-arrestin1敲低对细胞衰老的影响;利用RT-PCR与Western Blot分别检测衰老相关基因p53、p27、p21 mRNA表达,及衰老相关蛋白CBX与HIRA表达。利用RT-PCR、PCR-ELISA、Southern Blot分别检测端粒酶逆转录酶基因hTERT mRNA表达、端粒酶活性、端粒长度的变化。结果:与对照组相比,B-ALL骨髓单个核细胞中β-arrestin1的表达升高1.02倍(P<0.01),衰老细胞比例降低约31%(P<0.01),衰老相关标记p53、p21表达上调(P<0.01),p27表达无变化,β-arrestin1表达与衰老细胞比例负相关(R~2=0.4,P=0.003)。以Reh细胞为B-ALL LICs模式细胞,成功构建稳定敲低β-arrestin1的细胞株,与对照组Reh-Scram比较,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞比例增加56.4%(P<0.01),倍增时间缩短(P<0.05),细胞衰老相关标记p53、CBX、HIRA在Reh-Siβ1细胞内表达分别增高47%、126%、27%(P<0.05),端粒酶活性降低16.5%(P<0.05),端粒长度缩短11.42%(P<0.01),hTERT表达下调17.5%(P<0.05)。结论:B-ALL中β-arrestin1的表达升高,与衰老细胞比例呈负相关;成功构建β-arrestin1稳定敲低的Reh细胞株,为后续研究β-arrestin1调控B-ALL LICs细胞衰老提供基础。第二部分β-arrestin1促进Sp1与hTERT启动子结合来抑制Reh细胞衰老目的:复制性衰老主要由端粒酶逆转录酶(Human telomerase reverse transcriptase,hTERT)-端粒酶活性-端粒长度介导,其中hTERT m RNA表达影响端粒酶活性,进而调节端粒长度。hTERT表达受其转录影响,hTERT的转录活性受到多种转录因子调节,Sp1是其重要的转录因子之一。本部分重点研究β-arrestin1在B-ALL中调控hTERT转录的分子机制。方法:利用电泳迁移实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)实验检测Sp1蛋白与hTERT启动子转录调控区的结合;Western Blot检测Sp1蛋白表达;以PGL3-basic质粒为骨架,构建包含Sp1不同位点片段(Sp11、Sp11-2、Sp15+E-BOX、Sp11-5、NSp1+E-BOX)的载体,经双荧光素酶报告基因实验检测转录活性,探寻转录因子Sp1在hTERT转录调控区最重要的结合位点,并设计反义核苷酸片段验证其结合的特异性。结果:EMSA结果显示,Reh细胞核蛋白中存在与Sp1探针特异结合的大分子物质,迁移滞后的条带即Sp1-hTERT启动子复合物,敲低β-arrestin1后复合物含量明显减少;且敲低β-arrestin1后,Reh细胞Sp1蛋白的表达无变化(P>0.05),证明β-arrestin1影响Sp1与hTERT基因结合。成功构建以PGL3-basic质粒为骨架、包含hTERT启动子区Sp1不同结合位点片段的载体:Sp11、Sp11-2、Sp15+E-BOX、Sp11-5、NSp1+E-BOX。双荧光素酶基因报告实验发现:Reh-Siβ1细胞荧光素酶活性低于Reh-Scram组,两组细胞中Sp11-2片段的荧光强度最高,且明显高于其他Sp1结合位点片段(P<0.05);设计Sp12的反义核苷酸片段作用于Reh细胞,与对照组比较,双荧光素酶强度明显下降(P<0.05),hTERT表达下调(P<0.05),端粒长度缩短,衰老细胞比例增高。结论:B-ALL Reh细胞中,β-arresitin1促进Sp1结合于hTERT启动子区,促进hTERT转录,其中hTERT启动子区-28至-36bp是Sp1与hTERT的主要结合位点。第三部分小分子化合物促进B-ALL Reh细胞衰老的作用及机制初探目的:前两部分及前期的动物实验已证明B-ALL LICs衰老在B-ALL发生发展中起着重要作用,且初探其作用机制。随着衰老相关药物在肿瘤中的研究和临床试验的不断开展,本部分重点研究与细胞衰老相关的2个小分子化合物(端粒酶抑制剂BIBR1532和周期蛋白依赖激酶抑制剂SNS-032)对B-ALL Reh细胞的作用。方法:利用不同浓度BIBR1532与SNS-032小分子化合物,分别作用于B-ALL Reh细胞株,采用CCK-8检测细胞增殖,RT-PCR检测hTERT表达;Southern Blot及β-半乳糖苷酶染色检测BIBR1532作用Reh细胞后的端粒长度及衰老细胞的改变。利用IC50浓度的SNS-032作用Reh细胞,β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞;Hoechest染色检测细胞周期;AnnexinⅤ-APC/7-AAD染色检测细胞凋亡;利用RT-PCR检测p53、p21、p27、CDK1、CDK2、CDK9、XIAP与Mcl1的m RNA表达。结果:3μmol/l BIBR1532使Reh细胞hTERT的表达下降约40%,缩短端粒长度(Reh-Scram组缩短4.9%,Reh-Siβ1组缩短6.1%),增加β-半乳糖苷酶染色阳性衰老细胞比例,但与对照组比较生长无差异;SNS-032抑制Reh细胞增殖,且呈剂量依赖,IC50=0.119344μmol/l;利用0.12μmol/l SNS-032作用于Reh细胞,与对照组相比:Reh衰老细胞的比例增高46.8%(P<0.01),hTERT表达下降65%(P<0.05);p53m RNA的表达上调2.52倍(P<0.05),p27、p21表达无明显差异(P>0.05);细胞阻滞在G1期,周期蛋白CDK2表达减少(P<0.05),CDK1的表达有下降趋势,但无统计学差异(P>0.05),CDK9表达无差异(P>0.05);细胞凋亡比例增加89%(P<0.001),抗凋亡蛋白Mcl1表达下调(P<0.05),XIAP表达无差异(P>0.05)。结论:小分子化合物BIBR1532能下调hTERT表达,但不能有效抑制B-ALL LICs增殖;SNS-032能有效抑制B-ALL LICs细胞增殖,可能与调控细胞衰老、周期阻滞及凋亡有关。