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研究背景恶性腹水是由各种恶性肿瘤引起的腹水,多由肿瘤进展或转移引起。恶性腹水患者的平均生存期约为2-3个月,尤以胃肠道来源的最差,生存期不超过20周。肿瘤患者出现腹水,不仅会带来巨大的痛苦,更延误了积极的治疗机会,甚至引起营养匮乏、病情恶化,使生存期明显缩短。因此,如何有效减少恶性腹水,并减轻由此引起的相关临床症状,提高生存质量显得尤为重要。目前,现代医学的治疗手段主要包括利尿、腹腔穿刺引流、化疗、免疫治疗等。中医药因其副作用小、疗效好,在肿瘤治疗中越来越显示出其优势。华蟾素注射液作为干蟾皮的主要提取物,已广泛应用于临床中恶性腹水的治疗,具有较好的临床疗效,尤其对腹水局部辨证属于湿热毒证者疗效最佳。华蟾素注射液不仅能够有效缓解恶性腹水的发生、发展,同时能够使红色浑浊的腹水转澄清、降低腹水中红细胞数。其原因可能与华蟾素注射液能够抑制肿瘤新生血管形成相关。VEGF及其受体是促进血管生成的主要参与因子,在恶性腹水的形成和治疗方面发挥重要作用。因此,研究华蟾素注射液与结肠癌恶性腹水中VEGF及其受体之间的关系,对明确华蟾素注射液治疗结肠癌恶性腹水的机制、提高结肠癌恶性腹水的治疗疗效至关重要。基于上述内容,我们猜测华蟾素注射液能够抑制腹水中VEGF的表达,阻断VEGF与VEGFR-2的结合,减缓肿瘤新生血管形成,从而减少恶性腹水的产生。研究目的通过本研究,希望了解结肠癌血性腹水中,华蟾素注射液对VEGF、VEGF-mRNA和VEGFR-2等细胞信号通路的影响,明确华蟾素注射液对结肠癌腹膜转移肿瘤细胞信号通路VEGF表达的调节作用,初步阐述华蟾素注射液在治疗结肠癌腹水时的具体作用靶点和作用途径。研究方法本研究主要包括动物和细胞两部分实验,通过华蟾素注射液分别干预动物和细胞模型,从蛋白和基因层面揭示华蟾素注射液治疗结肠癌血性腹水时干预VEGF及其受体表达的情况,探索华蟾素注射液干预结肠癌血性腹水的可能机制。动物实验(华蟾素注射液干预荷瘤小鼠血性结肠癌腹水VEGF表达的研究)主要包括以下四部分内容:1、建立动物模型:我们尝试不同接种途径、不同细胞类型、不同接种剂量对小鼠的影响,建立符合课题需求的荷瘤小鼠血性腹水模型。2、华蟾素注射液剂量确定:我们设计并进行华蟾素注射液腹腔灌注的急性毒性试验,通过判断不同剂量干预后小鼠腹腔内各脏器的病理改变,明确华蟾素注射液的腹腔灌注安全剂量。3、荷瘤小鼠腹水量变化研究:药物干预后观察并记录各组小鼠腹水产生情况。4、荷瘤小鼠VEGF、VEGF-mRNA、VEGFR-2表达的影响:采用ELISA检测血性结肠癌腹水VEGF表达水平;WB检测小鼠肠系膜转移瘤VEGF、VEGFR-2含量;qPCR检测小鼠肠系膜转移瘤中VEGF-mRNA、VEGFR2-mRNA。细胞实验(华蟾素注射液干预人脐静脉内皮细胞代谢变化研究)主要包括以下两部分内容:1、华蟾素干预下HUVEC增殖变化:MTT检测HUVEC细胞凋亡情况;荧光显微镜观察用药前后细胞形态学变化。2、华蟾素干预下HUVEC中VEGF、VEGFR-2、VEGF-mRNA表达的影响:ELISA检测HUVEC细胞上清液中VEGF含量和细胞膜表面VEGFR-2含量;qPCR测定HUVEC细胞中 VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA 含量。研究结果1、结肠癌血性腹水的动物模型建立方法主要包括脾脏接种肿瘤细胞和腹腔接种肿瘤细胞两种。脾脏接种的方法更优于腹水的收集和计量,腹腔接种的方法则适用于与结肠癌腹水产生密切相关的肠、腹壁转移瘤的研究。2、华蟾素注射液腹腔灌注剂量不超过1ml时,不会引起小鼠肝、脾、肾脏器急性坏死,不会影响小鼠的体重、饮食等,属于安全剂量。3、华蟾素注射液呈浓度依赖性抑制荷瘤小鼠腹腔中腹水的含量。4、华蟾素注射液未降低脾脏组裸鼠血性腹水中VEGF表达量,各组腹水中VEGF含量无统计学意义(P>0.05)。腹腔组BALB/c小鼠肠系膜转移瘤中VEGF与VEGFR-2表达量在不同浓度华蟾素作用下均呈现不同程度降低,由高到低的表达量分别为低剂量、中剂量、高剂量,该变化具有统计学意义(P<0.05)。可见,华蟾素注射液呈浓度依赖性抑制小鼠肠系膜转移瘤中VEGF与VEGFR-2的表达。5、华蟾素注射液呈浓度依赖性降低腹腔组BALB/c小鼠腹腔转移瘤中VEGF-mRNA与VEGFR2-mRNA表达量,该变化具有统计学意义(P<0.05)。其中,高剂量华蟾素注射液对两种mRNA的抑制作用最强,中剂量其次,低剂量抑制作用最弱。6、华蟾素注射液对HUVEC细胞有明显生长抑制作用,其抑制率在10-80%之间,半数抑制浓度(IC50)为1mg/ml,药物最佳作用时间为24h。24h内,华蟾素注射液对HUVEC干预呈“时间-浓度”依赖性。7、华蟾素注射液呈浓度依赖性抑制HUVEC细胞VEGF及VEGFR-2的表达,差异具有统计学意义(P<0.05),其对VEGFR-2的抑制作用更高于相同剂量下对VEGF的作用(P<0.001)。8、华蟾素注射液能够抑制HUVEC细胞VEGF-mRNA和VEGFR2-mRNA的表达,且该抑制作用呈浓度依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05)。研究结论我们成功建立荷瘤小鼠结肠癌血性腹水模型和人脐静脉内皮细胞模型。在动物和细胞实验中,我们均从基因和蛋白层面,明确了华蟾素注射液对VEGF及其受体的下调作用,同时发现华蟾素注射液虽对VEGF及其受体均有抑制作用,但对VEGFR-2的抑制尤其明显。进一步揭示了华蟾素注射液治疗结肠癌血性腹水的可能机制是下调VEGF及其受体,特别是降低VEGFR-2的表达,抑制肿瘤新生血管形成,从而为华蟾素注射液治疗结肠癌血性腹水提供了科学依据。本研究从分子层面证实华蟾素注射液对结肠癌血性腹水中信号通路VEGF表达的调节作用,为推广华蟾素注射液腹腔灌注应用于临床中治疗结肠癌血性腹水提供了实验依据,为华蟾素抗肿瘤的机制研究提供了新思路。未来研究将继续对华蟾素注射液抗肿瘤新生血管作用进一步验证并深入探究其分子机制。