【摘 要】
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Myoz3蛋白是钙调神经磷酸酶肌小结结合蛋白家族(Myozs)成员之一,也是肌肉Z线的重要组成蛋白,在维持骨骼肌结构和功能方面发挥着重要作用,但目前我们尚不清楚它对肌细胞增殖、凋亡的影响以及它的转录调控机制。因此,在本研究中,我们首先检测了鸡Myoz3基因的mRNA表达模式,并通过qPCR、CCK-8、EdU、流式细胞术等技术探究了Myoz3对鸡骨骼肌卫星细胞增殖、凋亡的影响。接着,我们采用PCR
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Myoz3蛋白是钙调神经磷酸酶肌小结结合蛋白家族(Myozs)成员之一,也是肌肉Z线的重要组成蛋白,在维持骨骼肌结构和功能方面发挥着重要作用,但目前我们尚不清楚它对肌细胞增殖、凋亡的影响以及它的转录调控机制。因此,在本研究中,我们首先检测了鸡Myoz3基因的mRNA表达模式,并通过qPCR、CCK-8、EdU、流式细胞术等技术探究了Myoz3对鸡骨骼肌卫星细胞增殖、凋亡的影响。接着,我们采用PCR技术克隆获得鸡Myoz3基因5’转录调控区片段,利用生物信息学分析了Myoz3启动子的结构和功能,并通过定点突变、过表达、干扰、EMSA和ChIP技术研究了转录因子MyoD对鸡Myoz3基因的转录调控机制。本研究的主要结果如下:(1)Myoz3基因在胸肌中的mRNA表达水平显著高于腿肌。Myoz3在E15-D35期间的表达量存在差异,具体表现为:在E15-D6的表达量逐渐升高,在D2-D6期间达到最高峰,而在D27和D35的表达量急剧下降。在体外培养的卫星细胞中,Myoz3的表达量呈现出先升高后降低的趋势。(2)过表达/干扰鸡Myoz3基因后,骨骼肌卫星细胞中细胞周期相关基因PCNA、CDK2和cyclin D1的相对表达量都分别显著升高/降低(P<0.05)(3)CCK-8、EdU的结果表明,过表达和干扰Myoz3基因后,鸡卫星细胞的细胞活力和EdU阳性增殖细胞比例分别显著升高和降低(P<0.05);同时,我们通过流式细胞术检测发现,Myoz3表达量的上调使更多的卫星细胞处于G2期和S期,而Myoz3表达量的下调使更多的卫星细胞处于G1期。(4)干扰鸡Myoz3基因后,凋亡相关基因Bcl-2和Caspases3的表达量显著降低(P<0.05),而P53的表达量显著升高(P<0.05);过表达Myoz3基因后,凋亡相关基因的表达均没有发生显著变化(P>0.05)。流式细胞术结果表明Myoz3的过表达和干扰都没有使细胞凋亡数目发生显著改变。(5)双荧光素酶报告基因试验鉴定出Myoz3基因核心启动子位于-152/+240范围内,并预测到2个转录因子MyoD的结合位点(E-box)。定点突变试验结果表明MyoD结合位点的突变使启动子转录活性显著降低。过表达MyoD使启动子的转录活性显著增强。(6)过表达/干扰转录因子MyoD使卫星细胞中Myoz3的表达水平分别显著升高/降低(P<0.05);同时在不同生长发育阶段的胸肌中,Myoz3和MyoD的mRNA表达趋势是一致的;EMSA和ChIP分别在体外和体内证实鸡的转录因子MyoD通过MyoD的结合位点(CANNTG)与鸡Myoz3核心启动子序列发生结合。综上所述,鸡Myoz3基因的表达与鸡出生前后的肌肉生长发育密切相关,并正向调控骨骼肌卫星细胞的增殖,而转录因子MyoD通过启动鸡Myoz3基因的转录也参与到这一生物学过程中。
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