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2018年全世界肠癌的发病率居恶性肿瘤第三位,而其致死率高居恶性肿瘤的第二位。肠癌肝转移是导致患者死亡的主要原因,而肠癌肝转移患者多不具备手术根治的条件,且肠癌多为腺癌对放疗不敏感,化疗是主要的治疗方式。肠癌肝转移一线化疗药物(奥沙利铂+氟尿嘧啶+亚叶酸)具有剂量限制性毒性,且易引起耐药性。因此,急需研发肠癌肝转移一线化疗药物耐药后的高效低毒的二线治疗药物。基于青蒿素(ART)及双硫仑(DSF)临床治疗肠癌具有高效低毒的优势,为进一步开发治疗肠癌肝转移二线治疗药物,本论文采用BALB/c小鼠脾脏种植小鼠结肠癌CT26.WT细胞建立肠癌肝转移模型,青蒿素-β-环糊精包合物(ART-β-CD)或荷载青蒿素的偶联二十二碳六烯酸(DHA)的白蛋白(BSA)纳米粒(ART-DHA-BSA-NPs)联合双硫仑分别给药,研究结果如下:1.ART-β-CD的制备及质量评价利用饱和水溶液法制备ART-β-CD的包合物,利用红外光谱检测法对制得的产物进行鉴定,证明青蒿素和β-环糊精形成了稳定的包合物,其载药量为:17.0%±0.4%(n=3)。2.ART-DHA-BSA-NPs的制备及优化采用高压均质乳化法制得ART-DHA-BSA-NPs,通过正交实验和单因素实验确定制备ART-DHA-BSA-NPs的最佳制备条件。最终得到的最优制备条件为:偶联蛋白浓度1.5 mg/mL、有机相和水相体积比为1:9、匀浆速度10000 rpm、匀浆时间2 min、均质压力600 bar、均质次数9次。制备纳米粒ART-DHA-BSA-NPs的粒径为105.3±15.6 nm,电位为-37.92±1.07 mV。3.ART-DHA-BSA-NPs 的表征①扫描电镜(SEM):青蒿素在放大100倍的条件下观察,其多数呈现圆柱状结晶,粒径大小在100 μm左右;分别在放大20000倍和50000倍下对ART-DHA-BSA-NPs进行观察,其形状近似球形,粒径大小在100 nm左右。②X射线衍射(XRD):青蒿素分别在11.52°、14.23°、21.89°和44.69°处出现了衍射峰,并且峰强度较大;物理混合在20.47°处出现了一个较宽的衍射峰,在44.62°处出现一个小的衍射峰,且峰强度较弱;ART-DHA-BSA-NPs在21.05°出现一个较宽的衍射峰,且峰强度减弱,表明ART-DHA-BSA-NPs中青蒿素结晶度急剧减小,无定型部分大幅增多。③差示扫描量热法(DSC):青蒿素原药在156.4℃出现一个较强的热吸收峰,说明其为晶体形态,ART-DHA-BSA-NPs在相同位置出现一个极弱的热吸收峰,说明青蒿素以无定形态存在于ART-DHA-BSA-NPs中,而弱热吸收峰的存在,可能是极少量的青蒿素晶体吸附在ART-DHA-BSA-NPs表面形成的。4.ART-DHA-BSA-NPs 质量评价①建立青蒿素的标准曲线,得到其标准方程为:Y=1.095X+2.2233(R2=0.99925),根据标准方程计算出ART-DHA-BSA-NPs载药量为:8%±0.25%,包封率为:85.7%±6.1%。②建立二十二碳六烯酸的标准曲线,得到其标准方程为:Y=206831.9X+604058.8(R2=0.9935),根据二十二碳六烯酸的标准方程计算出ART-DHA-BSA-NPs中二十二碳六烯酸的含量为5.85%±0.3%。③复溶后的水分散液稳定性实验:将ART-DHA-BSA-NPs的冻干粉复溶于去离子水中,分别在复溶后0h、1h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h测量其粒径和电位的变化情况。粒径结果依次为:120.6 nm±16.5 nm、128.8 nm± 15.9 nm、135.5 nm± 18.3 nm、140.7 nm±14.8 nm、148.3 nm± 16.4 nm、150.9 nm± 18.2 nm、153.5 nm± 17.1 nm。电位依次为:-37.92 mV±1.13 mV、-38.79 mV± 0.97 mV、-39.91 mV± 1.06 mV、-38.87 mV±1.34 mV、-38.42 mV± 1.62 mV、-39.56 mV± 1.44 mV、-38.06 mV± 1.88 mV。在复溶后24 h内水分散液中没有沉淀和絮状物生成,ART-DHA-BSA-NPs粒径小于220 nm且电位的变化不显著(p<0.05)。5.药物的体外活性研究通过MTT实验,对药物抑制结肠癌CT26.WT肿瘤细胞增殖能力进行评估:ART组、ART-β-CD组、ART-DHA-BSA-NPs组、奥沙利铂组(阳性对照组)的IC50值分别为:85.94±1.7 μg/mL、71.22±2.3 μg/mL、50.72± 2.1 μg/mL、30.62±1.6 μg/mL(n=3,p ＜0.05)。6.药物的体内活性研究ART-β-CD包合物和双硫仑联用组:ART-β-CD包合物中ART剂量为200 mg/kg、给药双硫仑的同时给小鼠补充铜离子剂量为DSF/Cu:75/2.0 mg/kg。给药方式均采用灌胃。ART-DHA-BSA-NPs 和双硫仑联用组:ART-DHA-BSA-NPs 中 ART 剂量为 20 mg/kg、给药双硫仑的同时给小鼠补充铜离子剂量为DSF/Cu:75/2.0 mg/kg。给药方式:ART-DHA-BSA-NPs采用腹腔注射;双硫仑采用灌胃。阳性对照组(奥沙利铂组):奥沙利铂的给药剂量为5 mg/kg,给药方式采用腹腔注射。①平均生存期:空白组(生理盐水组)、ART-β-CD包合物联合双硫仑组、ART-DHA-BSA-NPs联合双硫仑组、阳性对照组(奥沙利铂组)小鼠的平均生存周期分别为:19.16 d±2.03 d、28.33 d±3.68 d、32.17 d±2.73 d、33.83 d±2.27 d。ART-β-CD 包合物联合双硫仑组和ART-DHA-BSA-NPs联合双硫仑组相比于空白组,平均生存期均有显著延长(n=6,p ＜0.05),且ART-DHA-BSA-NPs联合双硫仑组比ART-β-CD包合物联合双硫仑组小鼠的平均生存时间延长更显著(n=6,p＜0.05)。ART-β-CD包合物联合双硫仑组相比于阳性对照组,平均生存期有显著缩短(n=6,p＜0.05),而ART-DHA-BSA-NPs联合双硫仑组相比于阳性对照组平均生存期差异不显著(n=6,p＞0.05)。②体重变化:术后第15天空白组、ART-β-CD和双硫仑联用组、ART-DHA-BSA-NPs和双硫仑联用组、奥沙利铂组(阳性对照组)小鼠的体重分别为:22.97 g±0.15 g、22.68 g±0.09 g、22.60 ± 0.14 g、22.4g±0.12 g(n=6)。空白组、ART-β-CD 和双硫仑联用组、ART-DHA-BSA-NPs和双硫仑联用组、奥沙利铂组(阳性对照组)小鼠的体重差异不显著(p＞0.05)。③肝脏组织病理观察:空白组有较大量的肿瘤细胞呈现聚集生长,ART-β-CD包合物联合双硫仑组肿瘤细胞数目相对于空白组较少,ART-DHA-BSA-NPs联合双硫仑组肿瘤细胞数目较少且出现坏死,阳性对照组肿瘤细胞数目则更少。因此,表明ART-DHA-BSA-NPs联合双硫仑组在小鼠体内抑制肿瘤转移的能力强于ART-β-CD包合物联合双硫仑组,与奥沙利铂组无显著差异。综上所述,ART-DHA-BSA-NPs联合双硫仑抗肠癌肝转移活性显著强于ART-β-CD联合双硫仑(n=6,p＜0.05),与奥沙利铂抗肠癌肝转移活性无显著差异(p＞0.05)。本研究为急需的治疗肠癌肝转移的高效低毒的临床二线药物开发打下了坚实的理论和实践基础。