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为了保障粮食安全,粮食在收获后将有部分被贮存起来作为储备粮。粮食在储存过程中由于进行新陈代谢,品质不断下降的同时经济价值也会降低。如果储存条件控制不当更会加速这一过程造成粮食变质。对这类粮食进行深加工,提升其附加值具有重大的经济价值及社会意义。利用粮食中的淀粉为原料生产葡萄糖并联产L-苯丙氨酸可以大幅提高变质粮食的经济效益。L-苯丙氨酸属芳香族氨基酸,是人体八种必需氨基酸之一。由于其重要的生物学功能,L-苯丙氨酸被广泛应用于食品、医药、化工等领域,在世界市场的年销售额超过10亿美元。L-苯丙氨酸最主要的用途是作为保健型甜味剂阿斯巴甜的原料。该甜味剂具有甜度高、热量低、口味纯正等优点,深受世界各国消费者的青睐,消费量巨大。由于国内L-苯丙氨酸生产工艺落后、产能不足,我国在每年出口阿斯巴甜的同时需要从国外进口L-苯丙氨酸。基于L-苯丙氨酸的巨大市场价值及国内市场存在的供需缺口,本研究以L-苯丙氨酸专利菌NST74为出发菌株。在系统分析大肠杆菌NST74 L-苯丙氨酸合成途径的前提下,以代谢工程和现代分子生物学技术为手段,从细胞整体水平出发设计改造策略。分别对前体物质供应、合成限速步骤、L-苯丙氨酸转运系统等进行改造。并针对研究中遇到的实际问题进行理论探究。以期为获得L-苯丙氨酸高产菌株奠定基础。并为开发利用陈化变质粮食提供一条高附加值的途径。主要研究内容及结果如下：(1)克隆并共表达了负责莽草酸途径前体物质PEP及E4P供应的ppsA及tktA基因,构建共表达质粒pQST (pQH-ppsA-tktA)。 SDS-PAGE及酶活测定结果表明,共表达后的PpsA及TktA酶活性分别达到了NST74的7.4倍和8.1倍,并且两种酶的酶活提升幅度较为同步。pQST质粒的构建为莽草酸途径前体物质的充足供应提供了保障。(2)在共表达质粒pQST的基础上,克隆并共表达了NST74菌株中抗反馈抑制型的关键酶基因aroGfbr和pheAfbr以及转氨酶编码基因tyrB,构建了五基因共表达质粒pQSTERO (pQH-ppsA-tktA-pheAfbr-tyrB-aroGfbr)。酶活测定结果表明,与NST74相比,共表达后的AroG酶活性达到NST74的8.7倍,CM活性达到NST74的8.2倍,PD活性达到NST74的7.4倍,TyrB活性达到NST74的6.3倍。抗反馈抑制检测显示,在10mmol/LL-苯丙氨酸的压力下,AroGfbr保留了68.3%的酶活性,而CMtbr和pDfbr分别保留了87.4%和84.3%的酶活性。AroGfbr和PheAfbr均表现出明显的抗L-苯丙氨酸反馈抑制能力。共表达这两个酶的编码基因,可以有效破除莽草酸途径中的限速步骤,pQSTERO质粒的构建保障了莽草酸途径的畅通。(3)利用无痕敲除系统将NST74菌株的aroP基因进行敲除,限制菌体对环境中L-苯丙氨酸的摄取；在共表达质粒pQSTERO的基础上,克隆并共表达了L-苯丙氨酸外运蛋白的编码基因yddG,构建了六基因共表达质粒pQSTEROD (pQH-ppsA-tktA-pheAfbr-tyrB-aroGfbr-yddG)。利用摇瓶培养和硅胶层析对工程菌的L-苯丙氨酸生产能力进行初步检测,结果显示工程菌NST74△P (pQSTEROD)的L-苯丙氨酸产量与NST74相比提升最大。利用发酵罐对NST74△P (pQSTEROD)菌株的实际发酵能力进行了检测。经过48 h发酵,NST74△P (pQSTEROD)的L-苯丙氨酸产量达到了36.48 g/L,产率(L-Phe yield on glucose)达到了0.26 mol/mol。工程菌较对照菌NST74L-苯丙氨酸生产能力有了大幅度的提升。该菌株不仅拥有极大的生产潜力,并且为获得更高产的L-苯内氨酸工程菌株奠定了基础。(4)利用定点突变技术对有文献报道的三种抗反馈抑制型单位点突变aroGfbr进行了复原,并且在此基础上对三种单突变位点进行两两组合,创造出三种新的双位点突变aroGfbr。酶活性及抗反馈抑制能力检测结果说明,除AroG15/29外的双位点AroGfbr突变体与其相对应的单位点AroGfbr突变体相比,具有更高的初始酶活性以及更强的抗反馈抑制能力；实际发酵测试结果表明,除AroG15/29外的双位点AroGfbr突变体与其相对应的单位点AroGfbr突变体相比,对工程菌的L-苯丙氨酸产量及产率提升作用更为显著。双位点突变体AroG8/15在所有突变体中表现出了最高的初始酶活(8.39 U/mg)以及最强的抗反馈抑制能力(96.6%)。并且在实际发酵中W3110 (pQSERG8/15)的L-苯丙氨酸生产能力为所有工程菌中最高,产量和产率分别比对照菌W3110(pwtQSERG)提高了116%和31%,表明aroG8/15对于L-苯丙氨酸生产具有很高的应用价值。同时也说明组合已知突变位点并利用定点突变导入同一aroG基因是一种快速、有效构建抗反馈抑制型aroGfbr的方法。