研究背景大肠癌严重危害人类健康,为发病率最高的常见恶性肿瘤之一,其常由于治疗抵抗与转移而致死。目前在大肠癌组织中分选出一群CD133、CD44、CD166、 ALDH1等标记的细胞亚群,其虽在肿瘤组织中只占很小的比例,但具有很强的自我更新能力和多向分化潜能,称之为大肠癌肿瘤干细胞(Colorectal Cancer Stem Cells, CCSCs).miRNA为长度约18-25个碱基的单链非编码RNA,可在基因转录后阶段促使靶基因mRNA降解/或抑制靶基因mRNA的蛋白质翻译过程。在胚胎发育阶段中miRNA起着重要作用,疾病情况下尤其在肿瘤发生、发展过程中其同样发挥着关键的生物学作用。miRNA可起到促癌或抑癌的功能,miR-155可导致肿瘤信号通路的激活,let-7家族则可抑制肿瘤信号通路,miR-200家族等通过调控EMT过程而抑制肿瘤细胞的侵袭转移。miR-27b的编码基因位于9号染色体,研究发现在神经母细胞瘤中其可通过作用PPARy而发挥抑癌功能。在生理情况下,miR-27b则可通过促进内皮细胞的生长而促进血管形成。肿瘤干细胞在肿瘤组织中处于核心位置,具有明显区别于普通肿瘤细胞的恶性生物学特性,其与普通肿瘤细胞之间分子水平的差异亦可为肿瘤发生发展中的关键分子。大肠癌肿瘤干细胞与普通肿瘤细胞间差异1niRNA的研究不仅可进一步探究大肠癌发生发展中表观遗传学调控的分子机制,也可为大肠癌的基因治疗提供新的靶点和思路。研究方法本课题利用原代大肠癌肝转移细胞及ATCC标准细胞系,niRNA表达差异芯片筛选出多个差异的niRNA.结合课题组前期研究工作而对niR-27b进行深入研究,定量PCR检测配对的大肠癌组织及癌旁正常组织中miR-27b的表达水平。体内外实验验证其对大肠癌的细胞增殖、克隆形成及动物致瘤能力的影响,瘤内注射胆固醇修饰的miR-27b后HE染色、免疫荧光检测以评价其肿瘤治疗能力。结合生物信息学分析、荧光素双报告基因系统、蛋白免疫印迹实验等鉴定miR-27b的功能靶基因,并且甲基化特异性PCR等实验初步探讨了miR-27b的上游调控机制。本课题丰富了大肠癌研究的内容,不仅对大肠癌发生发展的分子机制有所阐明而且为基因治疗提供了合适的靶点。研究结果1.大肠癌肿瘤干细胞与普通肿瘤细胞具有明显差异的miRNA表达谱。前期大肠癌研究的工作基础证实,CD133+细胞亚群表现明显的肿瘤干细胞特性。在CD133+和CD133-细胞亚群中miRNA表达谱具有明显差异,对芯片结果中重复改变的miR-27b进行深入研究。在80对石蜡包埋的大肠癌组织及癌旁正常组织的检测中,miR-27b在60%的大肠癌组织中表达下调,仅在15%的大肠癌中表达上调,因此miR-27b在大肠癌中可能起到抑癌基因的作用。2.miR-27b能抑制大肠癌生长及血管形成。慢病毒感染成功建立niR-27b大肠癌细胞高表达/抑制的稳定细胞以验证其生物学功能。体外实验结果示miR-27b能明显抑制大肠癌细胞增殖及克隆形成能力,体内实验结果示miR-27b能显著抑制大肠癌的致瘤能力,老鼠负瘤模型上的肿瘤治疗实验证实：miR-27b具有抗肿瘤作用。所有结果证明在大肠癌中miR-27b表现抑癌基因的功能,提示其可成为潜在的抗癌药物。3.在大肠癌中VEGFC是]miR-27b的功能靶基因。miRNA是通过介导基因沉默而起功能的,因此,miRNA研究的要点在于其下游功能靶基因的筛选鉴定。我们证实VEGFC mRNA3’端非翻译区包含miR-27b的保守结合位点,荧光素双报告基因系统检测示miR-27b可引起miRNA靶基因报告载体荧光强度的明显改变。且大肠癌细胞中转染niR-27b后,无论细胞内还是培养上清中,VEGFC的蛋白表达都出现下调。在大肠癌细胞中抑制VEGFC表达,其恶性生物学表型可被明显逆转,证实VEGFC不仅为miR-27b的靶基因,更为其功能靶基因。4.启动子区DNA高甲基化可抑制miR-27b的表达。遗传学及表观遗传学可能涉及niR-27b的调控。甲基转移酶抑制剂5-aza-dC(5AZA)处理大肠癌细胞后miR-27b水平明显上调。通过荧光素双报告基因系统确认其位于9号染色体的启动子区,进一步的甲基化特异性PCR示大肠癌细胞中miR-27b的启动子区出现高甲基化,提示DNA高甲基化与其表达下调密切相关,并且,生物信息学分析出miR-27b可能为转录因子Evi-1及c-Rel等所调控。研究结论miR-27b能显著抑制大肠癌细胞的自我更新及致瘤能力,同时运用多种实验方法证明VEGFC为miR-27b的功能靶基因,我们首次报道了在大肠癌中miR-27b的功能及其靶基因。许多恶性肿瘤都具有异常表达的miRNA,这些小RNA为发展基因治疗提供了可能。很多肿瘤中都可发现,miRNA启动子的高甲基化,在本课题中同样发现在大肠癌中miR-27b启动子出现高甲基化。研究不仅丰富了大肠癌调控机制理论,更为以后发展有效的肿瘤治疗药物提供了一个新的靶点。