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异丁醇以高辛烷值、高能量密度、低蒸汽压、低吸湿性等优良特性成为新一代的生物燃料，随着合成生物学的发展，生物合成异丁醇成为国内外研究热点。 本文首先通过PCR从枯草芽孢杆菌168基因组中获得目标基因alsS，构建表达质粒pET30a(+)-alsS，从大肠杆菌MG1655基因组中分别获得目标基因ilvC、ilvD、yqhD，构建表达质粒pET22b(+)-ilvC、pET22b(+)-ilvD、pET30a(+)-yqhD，并分析重组质粒在E.coli BL21(DE3)中的表达情况。结果表明分子量大小为62.8kDa的乙酰乳酸合成酶(AHAS)、54.1 kDa的乙酰乳酸异构还原酶(AHAIR)、67.9kDa的二羟基酸脱水酶(DHAD)、42.7 kDa的脱氢酶(ADH)均得到有效表达，总蛋白分别为0.41、0.34、0.83、2.12 mg/mL，建立了乙酰乳酸合成酶和乙酰乳酸异构还原酶的酶活分析方法，测得它们的粗酶液酶活分别为3.42和4.02 U/mL。 其次，我们对异丁醇生物合成途径中占据重要地位的乙酰乳酸合成酶的诱导表达条件进行了优化，最佳表达条件为在LB培养基中，37℃，200 rpm培养至对数中期(OD600=0.6-0.8)时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，30℃诱导6h，酶活最高可达24.4 U/mL，比优化前提高了7.13倍。经镍柱亲和层析后获得电泳纯的AHAS，比活达到95.3 U/mg，比未纯化前提高了1.8倍。 最后，我们比较了单质粒双顺反子和双质粒双抗性两种模式下AHAS和AHAIR的共表达效果，发现双质粒双抗性模式下蛋白表达量和两个酶的酶活都要比单质粒双顺反子模式下的高。随后又研究了单质粒双顺反子体系中SD序列对基因表达的影响。结果表明两个基因之间无SD序列时，两个基因都无法正常表达;两个基因之间插入不同的SD序列时，第二个基因的表达水平会提高，第一个基因的表达水平会降低。在此基础上我们在ilvD基因前添加GAAGGAGATATACAT作为SD序列将ilvD基因连接在alsS-ilvC基因后面，构建三个基因的共表达重组载体，同样地采用双质粒双抗性和单质粒多顺反子两种模式进行共表达。经初步验证，两种模式下构建的重组菌在相同条件下反应后，反应液中均能检测到2-异戊酮酸(KIV)，说明三个外源基因在两种模式下均获得了成功表达。