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研究背景:骨折愈合是个复杂的生物学过程,尽管现代骨科治疗技术不断发展,仍有10%左右的骨折病例最终会发生延迟愈合或骨不连,常需要植骨手术治疗。骨愈合延迟的危险因素较多,因此,需要寻求更加安全有效的加速骨折愈合的方法。研究发现一些生物物理疗法正在用于骨愈合过程中的辅助治疗。低强度脉冲超声(Low intensity pulsed ultrasound,LIPUS)能产生经皮传递的非侵入性的机械能,可以加快并加强新鲜骨折的愈合,对于延迟愈合与骨不连有较好疗效。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类多能干细胞,具有强大的增殖能力和多向分化潜能,在骨折愈合过程中发挥重要作用,研究提示LIPUS促进BMSCs的成骨分化,然而具体作用机制尚不清楚。而牙髓间充质干细胞(dental pulp mesenchymal stem cells,DPSCs)作为一种有潜能的干细胞,具有较高的增殖能力且能够多向分化;其来源丰富,且无伦理争议。DPSCs作为一类优良的种子细胞,可能会为骨组织工程开辟一条新路。TRPM(Transient Receptor Potential Melastatin,TRPM)蛋白家族是一类表达于多种哺乳动物细胞中的广泛存在的离子通道,近年来发现它们在维持一些特定生理功能中起着关键作用,与人类某些疾病的发生发展密切相关。TRPM7是TRPM家族的第7号成员,是含有阳离子通道和蛋白激酶双重结构的膜蛋白,广泛分布于各种组织和器官中,能感应来自周围环境的多种刺激(如渗透压、温度、机械等)且具有机械敏感性。有研究表明TRPM7的缺陷能够导致骨形成障碍,且TRPM7同时作为一种机械敏感的质膜钙渗透性通道,在机械刺激介导BMSCs成骨这一过程中发挥着积极作用,可以介导胞质内钙增加,上调BMSCs的RUNX2表达。细胞骨架可以感受机械信号并且传导至胞内,一定的机械刺激可以导致细胞骨架F-actin解聚和重排,而细胞骨架的解聚和重排影响MSCs的成骨分化。本实验将探讨LIPUS是否有效促进BMSCs和DPSCs的成骨分化以及TRPM7在成骨分化过程中发挥的作用,并初步探讨在LIPUS作用下TRPM7所影响的胞内钙信号变化以及微丝是否解聚和重排,以期进一步理解LIPUS在调节MSCs成骨分化过程中的分子细胞作用机制。第一部分LIPUS促进BMSCs与DPSCs成骨分化目的:探讨LIPUS促进BMSCs与DPSCs成骨分化的效应。方法:分别培养小鼠BMSCs和人DPSCs,流式细胞分别检测两种细胞特异性表面标志表达,ALP染色和茜素红染色检测成骨分化能力,阿利新蓝和油红O染色分别检测成软骨及成脂分化能力。在成骨分化诱导培养基的作用下,将每种细胞分为两组:对照组(LIPUS未处理组)与LIPUS处理组。ALP染色、茜素红染色及ALP活性读数比较对照组和LIPUS处理组成骨分化能力的差异,qPCR检测成骨分化基因RUNX2、OPN、OCN的mRNA表达水平在LIPUS作用后表达的变化。结果:成功体外培养BMSCs与DPSCs并进行鉴定,BMSCs具有成骨及成脂分化能力,而DPSCs具有成脂、成骨及成软骨能力。与对照组比较,LIPUS处理后的BMSCs与DPSCs的ALP染色和茜素红染色都明显增强;ALP活性读数显著增高(*P<0.05,**P<0.01);成骨分化相关基因OPN、OCN、RUNX2 mRNA表达均明显增加(P<0.05)。结论:LIPUS促进BMSCs与DPSCs的成骨分化。第二部分TRPM7在LIPUS促BMSCs与DPSCs成骨分化中的作用目的:探讨机械敏感离子通道TRPM7在LIPUS促BMSCs与DPSCs成骨分化过程中的作用。方法:分别培养小鼠BMSCs和人DPSCs,每种细胞各自分为对照组和LIPUS处理组,检测LIPUS处理1d、2d、3d后TRPM亚家族的第7个成员TRPM7 mR NA表达水平与对照组的差异。免疫荧光检测LIPUS处理BMSCs1d、2d、3d后TRPM7细胞内表达部位和水平。随后分为四组:control组、LIPUS组、LIPUS+DMSO组和LIPUS+2-APB组。ALP活性读数、ALP染色和茜素红染色检测TRPM7通道抑制剂2-APB对LIPUS促BMSCs和DPSCs成骨分化的影响,WB检测成骨分化相关基因蛋白表达的差异。构建小鼠TRPM7过表达和siRNA干扰腺病毒载体,WB验证两种病毒的过表达和干扰效率。分为(Ad-RFP组和Ad-RFP+LIPUS组)、(Ad-TRPM7组和Ad-TRPM7+LIPUS组)、(Ad-siTRPM7组和Ad-siTRPM7+LIPUS组)共六组,两两对应。ALP活性读数、ALP染色和茜素红染色检测各组细胞成骨分化能力。WB检测Ad-RFP+LIPUS组和Ad-siTRPM7+LIPUS组两组TRPM7与成骨分化相关基因蛋白表达的差异。结果:体外培养获得BMSCs与DPSCs,与对照组比较,qPCR检测发现LIPUS处理后两种细胞TRPM7表达都明显升高(P<0.05)。免疫荧光染色显示,与对照组相比,LIPUS处理BMSCs后TRPM7表达量增加,主要表达在胞浆内。随后分为四组,LIPUS组、LIPUS+DMSO组与control组相比,ALP读数明显升高,ALP染色与茜素红染色可见阳性蓝紫色染色与红色钙结节明显增多;与LIPUS+DMSO组相比,LIPUS+2-APB组ALP读数明显降低,ALP染色与茜素红阳性染色明显减少;WB检测显示LIPUS+2-APB组中促成骨分化相关基因的蛋白表达较LIPUS+DMSO组明显降低。成功构建了小鼠TRPM7的过表达和siRNA干扰腺病毒载体,WB验证了TRPM7过表达和siRNA干扰的效率。ALP染色与茜素红染色发现,Ad-RFP+LIPUS组和Ad-TRPM7+LIPUS组阳性染色与各自对照组相比都明显增多,但Ad-TRPM7+LIPUS组的阳性染色明显多于Ad-RFP+LIPUS组,而Ad-siTRPM7+LIPUS组较Ad-RFP+LIPUS组相比明显降低;Ad-TRPM7+LIPUS组的ALP读数升高明显高于Ad-RFP+LIPUS组(*P<0.05),而Ad-siTRPM7+LIPUS组的ALP读数较Ad-RFP+LIPUS组相比有所降低(**P<0.01)。WB检测显示与Ad-RFP+LIPUS组相比,Ad-siTRPM7+LIPUS组成骨分化相关基因蛋白表达明显下降(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。结论:LIPUS处理能够明显上调BMSCs与DPSCs中TRPM7的表达,TRPM7在LIPUS促BMSCs与DPSCs成骨分化过程中发挥重要调控作用。第三部分TRPM7调节胞内钙振荡在LIPUS促微丝解聚过程中的作用初探目的:探究LIPUS作用后对胞内钙离子浓度和细胞骨架微丝的影响,以及TRPM7在这个过程中发挥的作用。方法:培养小鼠BMSCs,分为对照组和LIPUS组。应用Fluo-4试剂,流式细胞术检测两组胞内钙离子浓度变化情况。然后分为三组,LIPUS组、LIPUS+2-APB(2-APB抑制内质网作为胞内钙库的钙释放)组和LIPUS+无钙培养基组,检测三组胞内钙离子浓度变化差异。随后实验分为两组:Ad-RFP+LIPUS组和Ad-siTRPM7+LIPUS组,观察两组胞内钙振荡情况。BMSCs分为Control、LIPUS和2-APB+LIPUS三组,激光共聚焦观察BMSCs细胞骨架F-actin形态的变化。结果:体外培养获得BMSCs,流式检测发现LIPUS组与对照组相比,胞内钙离子浓度明显升高。应用2-APB及无钙培养基后,LIPUS引起的胞内钙离子浓度变化明显减弱。沉默TRPM7后,LIPUS作用胞内钙离子浓度变化也明显受到抑制。激光共聚焦可以观察到对照组细胞中分布较多束状的F-actin,在细胞内形成大量应力纤维,LIPUS处理后F-actin逐渐解聚,应力纤维形成减少。而2-APB作用后,微丝解聚得到抑制。体外培养大鼠BMSCs,免疫荧光镜下观察发现LIPUS作用后微丝发生解聚,而应用2-APB后,LIPUS促微丝解聚受到抑制。结论:LIPUS作用后引起胞内钙离子浓度升高,内质网钙库和胞外钙离子可能均有参与,可以部分通过TRPM7调节;LIPUS作为一种机械应力能够促进细胞骨架微丝的解聚,这一过程可能与TRPM7以及胞内钙释放有关,需进一步深入研究。