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醋酸菌是酿醋工业的核心微生物,本研究旨在筛选出一批同时耐乙醇,耐高温且产酸高的醋酸菌,探究其发酵特性并用于工业生产。从酶学方面初步揭示醋酸菌的耐乙醇机理。利用醋酸菌的耐高温高醇特性,进行酿造西瓜醋的实验研究。主要的研究内容及结论如下:1)利用传统的平板筛选方法从多个醋厂的醋醅中筛选出一批耐乙醇醋酸菌,从中进一步筛选耐高温和耐乙酸的菌种。最终共筛选出7株耐10%乙醇,40°C的高温,3%乙酸的醋酸菌,经过生理生化实验及16S r DNA菌种鉴定,7株醋酸菌被认定为巴氏醋杆菌(Acetobacter Pasteurianus)。2)对菌种培养条件优化,得到最优发酵条件为:温度30°C,转速180 r/min,发酵天数6 d,初始p H 6.0。比较了7株菌种的耐乙醇,耐高温,耐盐等性状,结果发现醋酸菌FY-24可耐受12%乙醇,43°C高温,1.2%的盐,最大产酸量达到61.2 g/L。在复合条件下比较FY-24与AS1.41在发酵罐中的发酵特性,结果表明:在同时面对高温和高乙醇时,FY-24依然保持较高的产酸量,而工业菌株AS1.41几乎失去产酸能力。因此,FY-24在工业发酵上有潜在的应用价值。3)从酶活方面研究了发酵过程中乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)与醋酸菌耐乙醇的关系,结果表明:高乙醇条件下,ALDH的酶活明显高于ADH,因此ADH成了高乙醇发酵过程中的限速酶。同时,醋酸菌对乙醇的耐受性与ADH和ALDH的酶活呈明显正相关:高乙醇条件下,酶活越高,菌种能转化的乙醇越多,菌种的生长越好,耐乙醇越强。研究了高温及乙酸对两种酶的影响,结果表明:FY-24和DY-5对高温的耐受性与它们的ADH和ALDH在高温时仍保持较高的活性正相关;醋酸的存在对ADH和ALDH的酶活有较强的抑制作用。耐乙醇醋酸菌FY-24和DY-5同时具有耐高温,耐酸特性,这两种特性有助于提升其对乙醇的耐受性。4)研究了乙醇对ADH的诱导作用,发现8%的乙醇可以诱导耐乙醇醋酸菌FY-24和DY-5中ADH的表达,但会抑制AS1.41中ADH的表达。对FY-24,DY-5,AS1.41纯化后的ADH进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果表明它们的ADH具有三个亚基,其分子质量分别为79 k Da(亚基I),57 k Da(亚基II),和15 k Da(亚基III)。研究了三株醋酸菌的ADH在不同乙醇,温度,乙酸条件下的稳定性,结果发现:FY-24和DY-5的ADH显示出比AS1.41更高的乙醇,温度,乙酸耐受性。对此,我们进一步研究了ADH的氨基酸序列,结果表明:醋酸菌FY-24,DY-5和AS1.41的ADH氨基酸序列中仅有极少的氨基酸有差异,这可能最终导致了ADH性能的差异。5)通过比较醋酸菌FY-24和AS1.41在高温下酿造西瓜醋时的生长及产酸特性,探究高温酿造西瓜醋的可行性。结果表明:醋酸菌FY-24在30-39°C之间酿造西瓜醋时可以良好的生长及高效的产酸,该菌种可作为酿造西瓜醋的专用菌种。为改善西瓜醋的风味,采用高乙醇(8%)酿造西瓜醋,采用高效液相色谱法,GC-MS等方法对西瓜醋的主要有机酸和风味物质进行了检测。结果显示:利用耐乙醇醋酸菌FY-24进行高乙醇发酵西瓜醋既提高了主要有机酸(草酸,酒石酸,甲酸,苹果酸,琥珀酸)的含量,又提升了风味物质尤其是酯类物质的种类及含量,这在工业上将具有较强的应用潜力。本研究为醋酸菌的筛选提供有价值的参考,拓宽了菌种的筛选范围。根据醋酸菌的酶学特性,为实际生产提供了部分理论依据。为以西瓜醋为代表的果醋找到专用菌种。