奶牛分娩前子宫是无菌的,分娩时子宫颈口开张,环境中大量细菌易入侵引起产后子宫细菌感染,导致奶牛不发情、不排卵和受胎率下降。奶牛因受孕困难或无法受胎而被淘汰,导致治疗和养殖成本急剧增加,严重影响奶牛养殖业的生产效益和可持续性发展。但奶牛体型庞大、经济成本高等因素制约了对子宫内膜炎症的深入研究。因此,本试验首先通过体外培养的方法分离子宫黏液中的病原菌,然后利用分离到的病原菌构建大鼠子宫炎症模型,通过对子宫内膜粘蛋白、紧密连接复合体和受孕功能调控基因的检测,探讨病原菌急、慢性感染造成子宫损伤的机制,以期为临床子宫内膜炎的预防和治疗提供理论参考。一产后奶牛子宫黏液中微生物的分离、鉴定及与黏液性状的关系选择产后荷斯坦奶牛18头,以产后21 d黏液性状评分和中性粒细胞计数为基础,将其分为健康组(9头),亚临床子宫内膜炎组(3头)和临床子宫内膜炎组(6头),通过对黏液中细菌分离培养和测序检测了产后奶牛不同时间、不同子宫状态子宫黏液中细菌种类和数量,分析细菌种类、数量与产后时间及黏液性状的关系。本试验共分离到407株纯菌,经测序后发现其分别属于变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门的25种细菌,其中大肠杆菌(44.14%)、芽孢杆菌(19.31%)、葡萄球菌(6.21%)、希瓦氏菌(4.83%)等分离率较高,在健康组和患病组奶牛子宫内均分离得到;蜡样芽孢杆菌、苏云金芽胞杆菌等只出现在健康牛子宫,克雷伯氏菌、不动杆菌、志贺氏杆菌、肾棒状杆菌、Helcococcus ovis只出现在患子宫内膜炎奶牛子宫。粘稠且不透明黏液分离菌株数(98株)显著多于半透明、白色脓性黏液(37株)和透明、偶带白丝型黏液(10株);其中产后35 d的菌株分离数量和粘稠黏液数量最多,粘稠型黏液共分离41株纯菌,占其细菌分离总数的74.56%,Helcococcus ovis、志贺氏杆菌、表皮葡萄球菌、不动杆菌等只从粘稠行黏液分离到;产后49 d至56 d,细菌分离数量及粘稠型黏液数量较产后35 d逐渐减少。结果表明大肠杆菌是感染产后奶牛子宫主要微生物,奶牛产后子宫感染细菌数量越多黏液脓性越高,并且奶牛产生子宫内膜炎及脓性黏液可能与不动杆菌、Helcococcusovis、志贺氏杆菌等病原菌感染有关。二以大鼠为模型研究病原菌短期感染造成子宫内膜损伤和子宫受孕功能障碍的机制本试验选取24只性成熟雌性SD大鼠随机分成3组,利用自行分离的奶牛生殖道大肠杆菌和金黄色葡萄球菌灌注大鼠子宫建立炎症模型,采集处理后24h的大鼠血液样品和子宫组织样品检测分析,首先通过检测子宫组织TLR受体及炎症因子表达探究病原菌是否侵入及炎症是否产生;其次通过对子宫内膜黏蛋白和紧密连接蛋白基因的检测研究病原菌感染对子宫内膜免疫屏障的影响;通过对胚胎附植调控基因的检测研究病原菌感染对子宫受孕功能的影响,探究病原菌短期感染(24 h)造成子宫内膜损伤和受孕功能障碍的机制。结果发现,金黄色葡萄球菌或大肠杆菌灌注24h后均导致子宫红肿、嗜中性粒细胞浸润,子宫组织中TLR2(TLR4)/Myd88/NF-κB信号通路分子表达显著上调,血液中炎症因子(IL-6,IL-1β,TNF-α,IL-8)浓度显著升高(P<0.05),说明,子宫发生严重炎症反应,造模成功。金黄色葡萄球菌感染24h,子宫内膜上皮紧密连接复合体Occludin和Claudin4基因表达显著提高,MUC1和ZO1的基因表达显著降低(P<0.05)。大肠杆菌短期感染导致MUC1、Occludin和ZO1的基因表达显著降低(P<0.05),说明病原菌短期感染显著改变紧密连接蛋白表达,削弱内膜屏障功能。HOXA10基因表达在大肠杆菌处理组显著下降,但在金黄色葡萄球菌处理组表达显著上升(P<0.05);LIF在两种病原菌急性感染的子宫中表达均显著下降(P<0.05)。此外,孕激素受体(PR)和雌激素受体(ER)基因表达在金黄色葡萄球菌急性感染24 h后均显著下降;在大肠杆菌急性感染24 h后PR表达量显著下降,ER基因表达量显著上升(P<0.05)。说明,病原菌短期感染显著改变胚胎附植调控基因的表达,干扰子宫受孕。上述结果表明,病原菌短期感染大鼠子宫24h可引起子宫炎症反应,降低子宫内膜表面粘蛋白和上皮细胞紧密连接蛋白的基因表达削弱内膜屏障作用,同时也显著改变胚胎附植过程调控基因的表达,干扰子宫受孕。三以大鼠为模型研究病原菌长期感染造成子宫内膜损伤和子宫受孕功能障碍的机制同本研究第二章,本试验选取24只性成熟雌性SD大鼠随机分成3组建立大鼠子宫内膜炎模型,采集处理后5 d的大鼠血液样品和子宫组织样品探究大肠杆菌或金黄色葡萄球菌长期感染对子宫内膜紧密连接蛋白基因及胚胎附植调控基因表达的影响,探索慢性子宫炎症造成子宫内膜损伤和子宫受孕功能障碍的机制。结果发现,与对照组相比,病原菌处理组子宫外观充血肿胀明显,子宫组织中有大量免疫细胞的浸润;同时子宫组织中TLR2(TLR4)/Myd88/NF-κB等信号分子表达量、血液中炎症因子(IL-6,IL-8,IL-1β,TNF-α)浓度显著提高(P<0.05),说明大肠杆菌或金黄色葡萄球菌感染后5d仍可导致大鼠子宫炎症。此外,大肠杆菌或金黄色葡萄球菌处理组大鼠子宫组织MUC1和紧密连接复合体主要成分Occludin、ZO1、Claudin4基因表达与对照组相比显著降低(P<0.05),表明子宫内膜屏障功能在病原菌感染5 d后被削弱;子宫组织中同源框基因A10(HOXA10)、白血病抑制因子(LIF)基因以及孕激素受体(PR)、雌激素受体(ER)表达与对照组相比显著下降(P<0.05),说明病原菌长期感染大鼠子宫5d仍可抑制胚胎附植调控基因的表达。结果表明,病原菌长期感染导致子宫产生炎症,子宫内膜黏蛋白1(MUC1)和紧密连接复合体的表达被下调,子宫内膜上皮屏障功能受损,同时子宫组织中调控胚泡着床相关基因(LIF、HOXA10)的表达被抑制,可能直接干扰子宫受孕。