一氧化氮对桃果实软化及线粒体单链结合蛋白的调控作用

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果实软化与细胞壁多糖物质的降解密切相关,充足的能量供应会延缓果实软化、抑制细胞壁的降解。线粒体是细胞进行能量代谢的重要细胞器,也是产生和积累活性氧(reactive oxygen species,ROS)的重要场所。ROS诱导线粒体产生氧化应激,并导致线粒体DNA(mtDNA)的损伤和突变,造成线粒体衰老和凋亡。线粒体单链结合蛋白(mitochondrial single-stranded binding protein,mtSSB)是参与mtDNA复制和损伤修复的重要蛋白,目前其在植物体中发挥的作用机理并不明确。一氧化氮(nitric oxide,NO)是生物体内重要的活性氮,在植物体中介导多种生理功能。研究证明,NO参与调控线粒体的生理功能,适当浓度的外源NO能减轻线粒体的氧化损伤,维持线粒体基本功能从而维持果实的储存硬度。本论文以“新泰红”桃果实为实验材料,分别用双蒸水、15μmol?L-1 NO和20μmol?L-1 c-PTIO(carboxy-PTIO,NO清除剂)进行浸泡处理后,研究0°C冷藏时,不同处理对细胞壁代谢、线粒体能量代谢和线粒体ROS含量以及mtDNA复制关键因子mtSSB的影响,结论如下:(1)NO处理可以通过抑制多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲酯酶、β-半乳糖苷酶、纤维素酶、木葡聚糖内转糖基化酶和葡萄糖苷酶的活性,抑制CDTA-果胶、Na2CO3-果胶、纤维素和半纤维素的减少以及H2O-果胶的增加,从而抑制桃果实细胞壁水解,维持果实贮藏期间的硬度,延长果实贮藏时间。(2)NO处理可以维持桃果实线粒体呼吸控制率,减少线粒体耗氧量和细胞色素c的含量,减少ROS(超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基)含量,提高H+-ATP合酶和Ca2+-ATP合酶的活性以及三羧酸循环中丙酮酸脱氢酶、柠檬酸合酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸硫激酶、琥珀酸脱氢酶、延胡索酸酶和苹果酸脱氢酶的活性。NO处理还维持了mtDNA的拷贝数以及mtDNA的完整性。表明NO可以通过调控线粒体内ROS含量以减少线粒体氧化损伤、维持线粒体功能,同时减少mtDNA的损伤,缓解线粒体的损伤和凋亡以提高线粒体内能量代谢水平。(3)使用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术克隆了桃果实中mtSSB基因,获得CDS区全长648 bp,共编码215个氨基酸。对mtSSB序列进行生物学分析,预测该蛋白的分子式为C1046H1678N302O321S6,具有亲水性,主要由α-螺旋和不规则卷曲构成,是四聚体结构,不存在跨膜区域和信号肽区域,与扁桃(Prunus Dulcis)、甜樱桃(Prunus avium)有较高的同源性,且靶向细胞器是线粒体。体外构建重组蛋白成功在BL21(DE3)中表达。同时结果显示,NO处理上调了mtSSB基因的表达,增加了mtSSB的拷贝数。
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