第一部分miR-96通过靶向BCR-ABL1融合基因抑制CML进展及其机制研究目的:慢性髓细胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)是一种起源于骨髓多能造血干细胞的恶性克隆性骨髓增生性疾病。其特征性的表现为t(9;22)易位形成BCR-ABL1融合基因,编码的BCR-ABL1融合蛋白在CML发病中起重要作用,BCR-ABL1融合蛋白具有酪氨酸激酶活性,酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)伊马替尼等通过靶向抑制BCR-ABL1蛋白的酪氨酸激酶活性,抑制CML细胞增殖,成为CML患者的一线治疗。但TKIs主要对慢性期的CML患者效果较好,对加速期和急变期患者疗效不显著。而且BCR-ABL1基因可发生突变从而对TKIs治疗产生耐药性,导致TKIs不能完全阻止CML的进展。因此,研究BCR-ABL1基因表达调控机制、通过调控BCR-ABL1基因表达阻断CML进展具有重要意义。MicroRNA(miRNA)是长度18～25个核苷酸左右的内源性非编码小分子RNA,miRNA可通过降解靶mRNA或阻遏其转录后翻译在转录后水平对基因表达起调控作用。研究表明miRNA在包括CML在内的许多恶性肿瘤中参与细胞增殖、分化、侵袭、转移和恶性转化等生物学过程。BCR-ABL1融合基因是CML发生的分子基础,在驱动CML疾病进展中也发挥重要作用。miRNA可否调控BCR-ABL1的表达进而阻断或逆转CML进展的相关研究少见。本研究发现CML急变患者骨髓标本中miR-96较慢性期表达明显减低,通过CML细胞水平研究发现miR-96对BCR-ABL1具有调控作用,进一步影响到CML细胞增殖、分化,在CML进展中的发挥作用,干预miR-96从转录层面调控BCR-ABL1,对慢粒急变具有潜在治疗作用。材料与方法:1.RT-PCR法检测CML患者骨髓细胞中miR-96的表达。收集 CML 慢性期(chronic phase,CML-CP)、急变期(blast crisis,CML-BC)患者及缺铁性贫血(iron-deficiency anemia,IDA)患者或健康个体骨髓样本,分离骨髓单个核细胞,提取总RNA,采用RT-PCR法检测miR-96表达水平。2.以CML急变细胞系K562和MEG01为研究对象,分别转染mi R-96模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitor),用 RT-PCR、Western Blot、细胞转染、流式细胞术、荧光素酶检测和DNA甲基化分析等方法研究miR-96通过靶向BCR-ABL1融合基因抑制CML进展的作用和机制。(1)分别将 miR-96 mimics 和 inhibitor 同野生型/突变型 BCR-ABL1 3’ UTR报告质粒转染K562和MEG01细胞,通过荧光素酶活性检测miR-96是否可以与BCR-ABL1的3’ UTR结合,Western Blot法检测BCR-ABL1融合蛋白的表达,探讨miR-96对BCR-ABL1的调控和作用机制。(2)通过EdU法测定分别转染miR-96 mimics和inhibitor后,观察K562和MEG01细胞增殖情况,探讨miR-96对CML细胞K562和MEG01增殖的影响。(3)分别用PMA诱导K562和MEG01细胞向巨核细胞方向分化,hemin诱导K562细胞向红细胞方向分化,RT-PCR法检测miR-96表达,流式细胞术检测分化表面标志CD61和CD71表达,探讨miR-96在CML细胞分化中的作用。(4)分别使用不同浓度西达本胺或地西他滨处理K562和MEG01细胞,RT-PCR法检测miR-96的表达,探讨CML中组蛋白乙酰化与DNA甲基化状态改变对miR-96表达的影响。(5)使用不同浓度伊马替尼处理转染miR-96 mimics的K562和MEG01细胞,用CCK8法检测并计算活细胞比例。探讨上调miR-96表达对伊马替尼杀伤K562和MEG01细胞的协同作用。结果:1.miR-96在CML急变中下调。检测38例CML-CP患者、12例CML-BC患者和22例IDA患者或健康个体骨髓样本中miR-96的表达。结果表明,与对照组相比,CML-CP中miR-96的表达降低(P<0.05);与CML-CP相比,miR-96在CML-BC中的表达水平进一步降低(P<0.05)。此外,CML-BC细胞株中miR-96表达也较CML-CP患者标本下调(P<0.001)。这些结果表明miR-96参与CML疾病进展。2.miR-96通过靶向3’ UTR区域抑制BCR-ABL1的翻译。TargetScan显示miR-96可以不完全互补地结合到BCR-ABL1的3’ UTR区域。将miR-96 mimics转染K562和MEG01细胞后,双荧光素酶检测显示野生型BCR-ABL1 3’UTR荧光素酶活性随miR-96表达的增加而降低,但对BCR-ABL1 3’UTR突变质粒无影响。同样,抑制miR-96导致野生型BCR-ABL1 3’UTR报告质粒的双荧光素酶活性增加,而突变质粒的双荧光素酶活性没有增加。这些结果表明miR-96可以与BCR-ABL1的3’UTR结合。同时,研究结果显示,miR-96在不调控BCR-ABL1 mRNA表达的情况下,抑制了 BCR-ABL1蛋白表达、自磷酸化(pTyr)以及下游STAT5和MEK/ERK信号通路活性。这些结果表明,miR-96通过抑制BCR-ABL1翻译来调控BCR-ABL1的表达和功能。3.miR-96低表达促进了 CML细胞的增殖。将mmiR-96的mimics转染到CML-BC细胞株K562和MEG01中,用EdU法测定细胞增殖,发现过表达miR-96可以显著降低CML细胞增殖(P<0.01);将miR-96 inhibitor转染到K562和MEG01细胞中,EdU检测结果显示,K562和MEG01细胞的增殖能力明显升高(P<0.01)。这些表明miR-96低表达促进了 CML-BC细胞的增殖。4.miR-96参与了 CML-BC细胞分化阻滞。在体外分化诱导模型中发现CML-BC细胞在向红细胞方向分化后miR-96表达升高,表明miR-96可能参与CML-BC细胞分化,在CML从慢性期向急变期的转变过程发挥作用。5.西达本胺和地西他滨介导CML-BC细胞中mmiR-96表达的恢复。组蛋白乙酰化修饰及DNA甲基化在miRNA的表达调控中发挥重要作用。我们的研究发现经组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺处理的K562和MEG01细胞中,miR-96表达呈浓度依赖性上调,BCR-ABL1表达下调,提示miR-96在CML-BC中的表达降低至少部分可被西达本胺恢复。此外,我们比较了 5例CML患者骨髓CD34+细胞与5例正常供体CD34+细胞的全基因组甲基化微阵列数据,发现miR-96启动子的两个甲基化位点存在异常高甲基化,用地西他滨处理CML-BC细胞后,miR-96的表达水平上调,表明CML-BC中miR-96的低表达同时受DNA异常高甲基化调控。6.上调miR-96表达增加了 CML-BC细胞对伊马替尼的敏感性。将不同浓度的伊马替尼加入转染miR-96 mimics的K562和MEG01细胞,用CCK8法检测并计算活细胞比例。我们发现,上调miR-96水平可以以浓度依赖的方式增加伊马替尼对CML-BC细胞的杀伤作用。结论:1.miR-96在CML急变中下调。2.miR-96直接与BCR-ABL1的3’ UTR结合,抑制其蛋白翻译、自磷酸化以及下游STAT5和MEK/ERK信号通路活性。3.miR-96低表达可促进CML-BC细胞增殖,参与细胞分化。4.CML患者miR-96启动子区存在CpG岛,且存在两个异常的高甲基化位点。西达本胺和地西他滨可能通过表观遗传机制恢复CML-BC中miR-96的低表达。5.上调miR-96的表达增强了伊马替尼对CML-BC细胞的杀伤作用。miR-96可能是干预CML急变的新靶点,基于miRNA的联合治疗为CML-BC的治疗提供了新的策略。第二部分miR-374a通过靶向c-MYC增加CML细胞对HHT的敏感性研究目的:慢性髓细胞白血病包含恶性程度递增的慢性期、加速期和急变期。酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)靶向抑制BCR-ABL的酪氨酸激酶活性,但TKIs主要对慢性期的CML患者效果较好,对加速期和急变期患者疗效不显著,而部分慢性期患者在用药后还会出现耐药和复发,最终进入疾病的终末期-急变期,此时TKIs疗效不佳,预后极差。因此,寻找新的治疗方法十分迫切。高三尖杉酯碱(Homoharringtonine,HHT)是从我国三尖杉属植物中分离出的抗肿瘤生物碱之一,属细胞周期特异性药物,主要通过抑制真核细胞的蛋白质合成,促进肿瘤细胞分化及凋亡发挥其抗肿瘤作用。研究发现当TKIs治疗的CML患者,出现包括T315I突变等耐药性突变时,HHT有显著的疗效,因此,CML诊治中国指南以及NCCN指南均推荐HHT做为TKIs耐药患者的治疗选择。然而,HHT在治疗CML中的确切机制尚未完全明了,而且其作为一种化疗药物,有心脏及骨髓抑制等毒副作用,限制了其广泛应用,因此寻找HHT的增敏剂、增加HHT的药物敏感性从而降低HHT的使用剂量,具有重要的临床意义。研究发现miRNA表达异常参与CML细胞对化疗药物的敏感性,比如,miR-124-3p通过miR-124-3p/B4GALT1轴增加CML细胞对化疗的敏感性;上调miR-424可抑制CML细胞的BCR-ABL活性和增加对伊马替尼的敏感性;miR-486调节CML祖细胞的药物敏感性。c-MYC是一个重要的原癌基因,在近一半的人类肿瘤中表达失调,并和细胞恶性转化和肿瘤进展密切相关,研究发现c-MYC异常高表达在CML细胞TKI耐药及急变中发挥很重要的作用。而miRNA调控c-MYC在多种疾病进程中发挥重要作用,例如扩张性心肌病,乳腺癌,前列腺癌,肝癌等。于是,我们将研究聚焦在可否通过miRNA调控c-MYC的通路增加CML细胞对HHT治疗的敏感性中。本课题通过研究发现CML患者骨髓标本中miR-374a低表达,尤其在急变期降低更为明显,在CML细胞系中miR-374a可调控c-MYC的表达影响到CML细胞增殖与凋亡,并且增加CML细胞对HHT的敏感性,另外,HHT能够以时间和剂量梯度依赖的方式上调miR-374a表达,miR-374a的重新表达能够增强CML细胞对HHT的敏感性,促进CML细胞凋亡,从而形成miR-374a-c-MYC-HHT环路发挥抗肿瘤作用。材料与方法:1.RT-PCR法检测CML患者骨髓标本单个核细胞中miR-374a的表达。收集CML慢性期和急变期患者及对照组的骨髓标本,分离骨髓单个核细胞,提取总RNA,采用RT-PCR法检测miR-374a表达水平。2.以CML细胞系K562为研究对象,分别转染miR-374a mimics和inhibitor,用RT-PCR、Western Blot、细胞转染、流式细胞术等方法研究miR-374a通过靶向c-MYC基因增加CML细胞对HHT的敏感性作用和机制。(1)流式细胞术检测转染miR-374a mimics,添加HHT后K562细胞凋亡情况,检测miR-374a协同HHT诱导K562细胞凋亡情况。(2)流式细胞术检测分别转染miR-374a mimics和inhibitor后K562细胞凋亡情况,探讨miR-374a对K562细胞凋亡的影响;同时转染miR-374a inhibitor 和 c-MYC 过表达质粒,同时转染 miR-374a mimics 和 c-MYC siRNA 后K562细胞凋亡情况,探讨miR-374a是通过调控c-MYC来影响K562细胞凋亡。(3)分别按照浓度梯度和时间梯度用HHT处理K562细胞,RT-PCR法检测miR-374a和c-MYC的表达,Western Blot法检测c-MYC蛋白的表达,流式细胞术检测K562细胞凋亡情况,探讨CML中HHT对miR-374a和c-MYC表达的影响,以及HHT、miR-374a、c-MYC三者在K562细胞凋亡中的作用关联。结果:1.CML患者骨髓标本单个核细胞中miR-374a的表达下调,尤其在急变期降低更为明显。2.上调miR-374a表达增强K562细胞对HHT的敏感性。与对照组相比,单独转染miR-374a mimics能诱导K562细胞凋亡;与单独转染miR-374a mimics相比,转染miR-374a mimics加HHT诱导K562细胞凋亡更明显(P<0.05),表明miR-374a mimics能够增强HHT诱导的细胞凋亡(P<0.05),即上调miR-374a表达增强了 K562细胞对HHT的敏感性。与单纯转染miR-374a mimics组相比,转染miR-374amimics加HTT后miR-374a的表达更高(P<0.01),表明HTT也对K562细胞miR-374a的表达产生影响。3.c-MYC表达下调是miR-374a表达上调增加K562细胞对HHT的敏感性的原因之一。生物信息学技术分析表明miR-374a可能直接与CML发生发展过程中重要的癌基因c-MYC的3’ UTR结合,c-MYC可能是miR-374a发挥抗白血病作用的靶点之一。和对照组相比,转染miR-374a mimics后,miR-374a表达上调(P<0.01),c-MYC mRNA水平和蛋白水平均表达下调(P<0.05),和单纯转染miR-374a mimics组对比,转染miR-374a mimics加HHT组c-MYC表达下调更加明显(P<0.05)。反之,和对照组相比,转染miR-374a inhibitor后,miR-374a表达下调(P<0.01),c-MYC mRNA水平和蛋白水平均表达上调(P<0.05)。分别将miR-374a inhibitor和c-MYC siRNA转染至K562细胞,发现上调miR-374a表达和下调c-MYC表达均能诱导细胞凋亡(P<0.05)。与之相反,分别将miR-374a inhibitor和c-MYC过表达质粒转染至K562细胞,细胞凋亡被抑制(P<0.05;P<0.05)。回复实验显示c-MYC过表达后miR-374a mimics诱导的凋亡被部分逆转。4.HHT介导CML中miR-374a表达的恢复将K562按照HHT浓度梯度和作用时间梯度分别孵育72h和96h,结果显示miR-374a表达呈现HHT剂量和时间依赖性增加(P<0.01),c-MYC mRNA和蛋白质表达呈现HHT剂量和时间依赖性下调(P<0.01)。这些结果证明HHT能够介导K562细胞中miR-374a表达的恢复。结论:1.CML-CP患者中mi R-374a的表达明显低于对照组,在CML-BC患者中miR-374a的表达低于CML-CP,上调miR-374a表达可促进K562细胞凋亡。上调miR-374a联合HHT增加K562细胞凋亡,增加了 K562细胞对HHT的敏感性。2.miR-374a可能通过c-MYC的介导增加了 K562细胞对HHT的敏感性。即通过miR-374a-c-MYC途径发挥抗白血病作用。3.HHT能够以时间和剂量梯度依赖的方式上调miR-374a表达,miR-374a的重新表达能够增强K562细胞对HHT的敏感性,促进K562细胞凋亡,从而形成miR-374a-c-MYC-HHT环路发挥抗肿瘤作用。miRNA和HHT联合应用可能成为干预CML的新策略。