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第一部分蛋白激酶Cα和周期蛋白D1在吸烟患或不患慢性阻塞性肺疾病患者肺血管中的表达变化目的检测蛋白激酶Cα(PKCα)和周期蛋白D1 (cyclinD1)在吸烟患或不患慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺血管中的表达变化并探讨两者在吸烟导致的肺血管重构中的作用。方法将35例因肺癌而行肺叶切除术患者的外周肺组织标本分为三组：不吸烟肺功能正常组(正常组)10例,吸烟肺功能正常组(吸烟组)14例,吸烟伴COPD组(COPD组)11例。采用苏木精-伊红(HE)染色观察肺小动脉形态学改变,应用免疫组织化学染色法检测肺小动脉平滑肌细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、增殖细胞核抗原(PCNA)、PKCα和cyclinD1蛋白表达,以PCNA阳性细胞百分率表示平滑肌细胞增殖指数(PI),采用实时荧光PCR法检测肺小动脉平滑肌细胞中]PKCa mRNA、cyclin D1 mRNA的表达。结果(1)肺小动脉血管壁面积占血管总面积的百分比值(WA%)在吸烟组和COPD组均高于正常组。(2)吸烟组和COPD组PI均高于正常组(P<0.01)。(3)吸烟组、COPD组PKCa蛋白和cyclinD1蛋白表达吸光度(A)值较正常组均显著升高(P<0.01)。(4)吸烟组、COPD组PKCa mRNA和cyclinD1 mRNA表达水平较正常组均显著升高(P<0.01)。(5)PKCa蛋白表达水平分别与WA%、PI呈正相关(P<0.01),cyclinD1蛋白表达水平分别与WA%、PI呈正相关(P<0.01),PKCa与cyclin D1在蛋白和mRNA表达水平均呈明显正相关(P<0.01)。结论在吸烟者及早期COPD患者肺血管中PKCa和cyclinD1表达均显著上调,二者可能参与肺血管重构中肺动脉平滑肌细胞的异常增殖。第二部分周期蛋白D1在香烟烟雾提取物促进人肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用目的本文旨在探讨周期蛋白D1(cyclinD1)在香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)所致人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)增殖中的作用。方法用不同浓度的CSE(1%,2.5%,5%,10%,20%)干预同步化的HPASMCs。构建反义cyclin D1基因真核表达载体(pIRES2-EGFP-ascyclin D1),采用脂质体介导基因转染法将空载体(pIRES2-EGFP)和pIRES2-EGFP-ascyclin D1导入正常HPASMCs后,分别进行CSE(5%)干预。细胞随机分为6组：对照组、空载体组、反义cyclinD1组、5%CSE组、空载体+5%CSE组、反义cyclin D1+5% CSE组。用台盼蓝染色法检测不同浓度CSE干预的HPASMCs活细胞率,采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)、流式细胞术、增殖细胞核抗原(PCNA)染色法测定细胞增殖能力,用实时荧光RT-PCR和Western blot法分别检测cyclin D1 mRNA和蛋白的表达。结果低浓度的CSE(1%,2.5%,5%,10%)促进HPASMCs增殖,且浓度5%时细胞增殖能力最强,高浓度的CSE(20%)对HPASMCs具有毒性作用,抑制细胞增殖。反义cyclin D1基因真核表达载体pIRES2-EGFP-ascyclin D1成功构建,并成功转染入HPASMCs,转染后HPASMCs中cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平较对照组均显著下降(P<0.05)。与对照组比较,5%CSE组cyclin D1的nRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05),细胞增殖能力显著增强(P<0.05)。与5%CSE组比较,反义cyclin D1+5% CSE组cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平均明显下降(P<0.05),细胞增殖能力显著降低(P<0.05)。结论CSE可通过上调cyclin D1表达促进HPASMCs增殖,反义cyclin D1基因真核表达载体可抑制CSE介导的HPASMCs增殖,提示cyclin D1在CSE促进HPASMCs增殖中发挥重要的正向调控作用。第三部分蛋白激酶Cα和周期蛋白D1在香烟烟雾提取物促进人肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用和关系目的研究蛋白激酶Cα(PKCα)和周期蛋白D1(cyclin D1)在香烟烟雾提取物(CSE)促进人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)增殖中的作用和关系。方法用5%浓度的CSE干预同步化的HPASMCs。通过Western blot法检测PKCα蛋白在胞浆和胞膜中的表达。采用小干扰RNA (siRNA)技术分别剔除PKCα和cyclin D1基因表达。用实时荧光RT-PCR法检测cyclin D1 mRNA表达,Western blot法检测PKCα和cyclin D1蛋白的表达。采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)和细胞计数法测定细胞增殖,流式细胞术观察细胞周期变化。结果5%CSE可激活PKCα,PKCα蛋白由胞浆转移至胞膜表达。通过Go6976抑制PKCα活性或采用siRNA技术剔除PKCα基因表达可显著抑制CSE介导的HPASMCs增殖和细胞周期的G1期向S期转换。5%CSE促进HPASMCs增殖中,cyclin D1mRNA和蛋白表达水平均明显升高。转染cyclin D1 siRNA可抑制CSE介导的HPASMCs增殖。此外,使用Go6976或转染PKCa siRNA可显著抑制CSE介导的HPASMCs中cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平升高。结论香烟烟雾提取物通过蛋白激酶Cα途径上调周期蛋白D1表达促进人肺动脉平滑肌细胞增殖。