逆运复合物是一种多聚体的蛋白复合物,其主要功能是促进多种跨膜蛋白的细胞内转运过程。空泡蛋白分选相关蛋白35（Vacuolar protein sorting-associated protein 35,VPS35）是逆运复合物中货物识别亚单元中的关键组成部分,与包括阿尔茨海默病在内的神经退行性相关疾病的病理生理变化息息相关。当VPS35发生功能紊乱时（通过耗尽/突变）,逆运复合物的功能活性受损而产生多种病理后果,其中参与神经退行性病变相关级联反应的蛋白分子以及特异的逆运复合物货物蛋白也将受到损害,同时将会影响下游信号分子的传递。VPS35的表达无处不在,在整个中枢神经系统中都能检测到VPS35的表达,其中VPS35在神经元中的作用受到了大量的关注和研究。神经元中的VPS35参与了多种关键细胞过程的调节,如淀粉样前体蛋白（APP）转运和蛋白水解过程的调节、神经递质受体的转运、线粒体融合/分裂动力学,以及神经递质受体的建立和调节等关键细胞过程。但对于小胶质细胞VPS35的功能却尚不十分明确。近年来的研究发现在阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）病人的小胶质细胞中检测到VPS35的表达水平降低。小胶质细胞VPS35缺乏可减少细胞膜上小胶质细胞吞噬受体的表达,损害小胶质细胞的吞噬能力。虽然这些观察结果提示小胶质细胞VPS35参与AD的发病机制,但小胶质细胞的细胞功能究竟是如何受到VPS35缺陷的影响,以及VPS35缺陷的小胶质细胞是如何影响其周围神经组织的,尚不清楚。此外,缺血性脑损伤作为神经退行性疾病的环境致病因素之一,同时也是临床上最为常见的颅脑疾病,约占脑血管疾病发病率的70%,其高死亡率以及高致残率近年来受到了广泛的关注。当发生缺血性脑损伤时,首先血流受阻,阻碍氧气和葡萄糖的输送,形成缺血状态,导致能量损耗、谷氨酸受体过度活化、谷氨酸兴奋性毒性作用以及神经炎症反应,最终导致神经细胞大量死亡。而小胶质细胞是缺血性脑损伤的第一道防线,伴随转录调控和形态学的改变小胶质细胞可在伤后迅速聚集到损伤部位,释放效应分子,参与免疫应答,吞噬已死亡的细胞碎片。我们前期体外实验的结果发现,小胶质细胞系中敲除VPS35,小胶质细胞活化增强而炎症反应加重和白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）表达增加。VPS35功能失调的小胶质细胞在炎症级联反应有何种关系,目前尚不清楚。因此我们试图探讨小胶质细胞VPS35在中枢神经系统功能维持和缺血性脑损伤中发挥何种作用,本研究分为以下两部分进行。第一部分,我们试图探寻小胶质细胞VPS35在中枢神经系统中扮演何种角色。通过RT-PCR技术在E17、P7、P14、P21、P60时间点对VPS35基因表达量的检测中发现,VPS35不仅仅在神经元中表达,同时在小胶质细胞的胞体和细胞突起上广泛表达。VPS35的表达量在小鼠不同年龄阶段各不相同（E17-P60）,在P14天时达到高峰,随后逐渐下降,通过LPS刺激小胶质细胞后VPS35水平明显升高,提示VPS35与LPS刺激的小胶质细胞反应有关。随后我们通过Cre-LoxP基因编辑系统首次培育了VPS35^CX3CR1小鼠,一种小胶质细胞上VPS35特异性敲除的基因敲除小鼠模型。经免疫荧光和western blot的检测证实该小鼠模型的原代培养小胶质细胞的VPS35已经成功被清除。VPS35^CX3CR1小鼠中的小胶质细胞在AD病最容易受损害的区域-海马和内嗅皮层区域,特别是海马DG（齿状回）和SGZ（颗粒下层）区域密度明显升高,同时我们对该区域的小胶质细胞的形态学进行观察发现,在VPS35^CX3CR1小鼠中SGZ区域的小胶质细胞胞体和凸起长度明显增加。小胶质细胞密度和小胶质细胞形态变化往往提示与小胶质细胞活化程度增加有关。此外,多种小胶质细胞活化标志物（IBa-1、CD11b、CD16/32）的荧光染色以及western blot结果表明,小胶质细胞VPS35敲除后与在海马和SGZ区域小胶质细胞活化增加关系密切。为了检测小胶质细胞的增殖,我们使用细胞增殖标记物BrdU（5-Bromo-2-deoxyUridine,5-溴脱氧尿嘧啶核苷）标记,在24h后的脑片染色结果显示敲除组和对照组小胶质细胞增殖情况无显著差异。提示增加的小胶质细胞不是增殖来源。随后我们利用BrdU标记7d后的方法检测小胶质细胞的分化或迁移,结果提示VPS35敲除组BrdU染色标记显著增加。表明增加的小胶质细胞可能来自于分化增加或者迁移。此外BrdU+的细胞明显增加主要集中在VPS35^CX3CR1小鼠的SGZ区域,而该区域是成年海马神经发生存在的主要区域,提示有NSC/NPC（neural stem/progenitor cell,神经干细胞/神经前体细胞）增殖和存活率增加。使用Ki67（一种标记分裂期细胞的标记物）与BrdU免疫荧光共定位,结果表明敲除组双阳性的细胞数量显著增加。而BrdU与未成熟神经元标志物DCX免疫荧光共定位结果却相反,敲除组共定位细胞数明显少与对照组。随后,免疫荧光定量分析以及western blot结果显示DCX的表达量显著降低。利用逆转录病毒标记神经元,1月后观察被标记的神经元形态学变化,结果VPS35^CX3CR1小鼠的DG区域的神经元树突凸起长度,复杂性和树突棘密度均出现明显减少。以上结果共同提示,小胶质细胞VPS35敲除增加了NSC/NPC的同时减少其向神经元的分化并且阻碍了细胞周期的退出,干扰了成年小鼠海马神经发生,提示在成年小鼠CNS中小胶质细胞VPS35对新生神经元成熟化过程中的调节作用,小胶质细胞VPS35缺陷将导致突触整合前的新生神经元出现神经退行性病变样的形态学变化。为了探索小胶质细胞缺乏VPS35后是如何影响神经元的机制,我们采用原代小胶质细胞与原代神经元细胞共培养技术,观察到缺乏VPS35的小胶质细胞对神经元突触后物质的吞噬作用增强。提示对小胶质细胞出现了对周围神经元的异常修剪。最后,为了探索小鼠神经发生异常是否会影响神经功能,我们通过旷场实验、Y迷宫、强迫游泳、蔗糖偏好等多种行为学实验,证实小胶质细胞VPS35敲除后的小鼠存在长期记忆损害以及类似焦虑的行为学改变。第二部分,由于已经发现小胶质细胞VPS35对小胶质细胞活化产生影响,而小胶质细胞的活化与炎症反应息息相关。因此,我们采用以神经炎症反应为主要病理变化的缺血性脑损伤模型来探索小胶质细胞VPS35的作用。首先,我们使用光血栓脑卒中法（photothrombotic cortical stroke injury）,在受试小鼠的运动皮层区域建立缺血性脑损伤模型。采用TTC（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,2,3,5-氯化三苯基四氮唑）染色、尼氏染色、免疫组化、免疫荧光等技术评估小鼠缺血性脑损伤后损伤部位的大小和神经元细胞死亡数量以及严重程度,结果提示VPS35^CX3CR1小鼠在缺血性脑损伤3d后大脑皮层缺血梗死区域明显减小,死亡的神经元数量显著低于对照组。同时利用神经功能评分、步态滑落实验、胶带清除实验来评估损伤后的运动神经功能缺陷,结果表明VPS35敲除组的小鼠的运动功能损害明显较对照组轻微。通过免疫荧光和western blot检测第一阶段DAM（Damage Associated Microglia,损伤相关小胶质细胞）标志物TMEM119、第二阶段DAM标记物LPL在缺血损伤后3d的差异,结果显示在梗死灶周围区域VPS35敲除组中TMEM119阳性小胶质细胞明显增加,而LPL阳性的小胶质细胞显著减少,提示在小胶质VPS35敲除可以干扰两个阶段DAM的产生。使用小胶质细胞活化标志物IBa1、M1型极性标志物iNOS、M2型极性标志物CD206通过免疫荧光、western blot等方法检测损伤后小胶质细胞的活化反应以及小胶质细胞的极性改变,以及趋化因子受体CX3CR1水平的变化,结果显示在损害后3d,VPS35敲除组的小胶质细胞在梗死灶周围区域密度显著增加,形态和分布出现明显差异,M1型促炎反应相关的小胶质细胞比例降低,M2型神经保护效应相关的小胶质细胞比例明显升高。应用RT-PCR技术检测在缺血后6h、1d、3d、7d小鼠的炎症因子和M1型M2型小胶质细胞相关基因Arg1、YM1/2、CD206、CD86、CD32、iNOS的mRNA水平差异,结果显示各时间点VPS35敲除组的小胶质细胞均偏向M2的极性活化,与之前的免疫荧光和western blot结果一致。通过免疫荧光和western blot检测趋化因子的特异性受体-CX3CR1表达变化,结果显示在VPS35敲除组的梗死灶周围区域CX3CR1表达降低,与先前报道的CX3CR1功能缺失后减轻缺血损伤反应一致。综上所述,我们的研究首次揭示了VPS35对维持小胶质细胞内环境稳态至关重要。在CNS中当小胶质细胞VPS35功能受到破坏时,产生的影响不仅是小胶质细胞本身,并且通过干扰其周围的神经干细胞和神经前体细胞的分化和增殖来影响关键的神经发生过程。另外,在皮层缺血性脑损伤模型中我们首次发现了小胶质VPS35的缺失可以起到一种保护作用。该保护作用可能主要是影响了小胶质细胞的活化极性,减轻神经炎症反应发挥神经保护作用。同时初步揭示在缺血性脑损伤反应中CX3CR1可能是小胶质VPS35的潜在货物蛋白,但仍然需要进一步研究来验证。我们的发现为探寻逆运复合物疾病相关货物蛋白以及介质在以小胶质细胞活化为主的神经系统疾病中的作用和作为调控治疗靶点提供了重要的实验证据。