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目的:探讨自身抗原牛胰岛素诱导免疫耐受防止1型糖尿病(T1D)模型小鼠发病的作用及其机制;研究体内树突状细胞(DC)及CD4~+CD25~+调节性T细胞在自身抗原胰岛素诱导T1D小鼠免疫耐受中的作用;通过过继动物体内处理及体外修饰的耐受性DC,观察其对T1D发病的影响并探讨其作用机制。方法:(1)低剂量链脲佐菌素(STZ)(40 mg/kg)连续5次腹腔注射建立BALB/c小鼠T1D模型。造模前1天采用自身抗原进行免疫干预,皮下注射牛胰岛素与不完全弗氏佐剂(IFA,1:1)混合乳剂1次(100μg/只),以后每周1次,连续4 w;灌胃给以胰岛素PBS液(150μg/只),以后每周给药2次,连续4 w。每周测定血糖,6周后处死所有动物,取胰腺进行HE染色作病理组织学检查,采用原位末端标记法作胰岛β细胞凋亡检测。分离脾脏淋巴细胞并进行体外培养,MTT法测定小鼠脾淋巴细胞增殖反应。ELISA法测定血清细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10的含量。(2)上述实验结束处死动物过程中,分离骨髓DC前体及脾脏淋巴细胞并进行体外培养,通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4诱导DC产生。采用流式细胞术(FACS)测定DC表型和CD4+CD25+调节性T细胞。同种淋巴细胞刺激实验检测DC刺激淋巴细胞增殖功能。ELISA法测定DC分泌IL-12p70的量。(3)体外分离BALB/c小鼠骨髓前体细胞,于GM-CSF+IL-4条件下培养的DC为DC0,仅GM-CSF培养为DC1,GM-CSF+IL-4+人工虫草(PHC)提取物条件下培养的为DC2。自身抗原胰岛素皮下注射诱导T1D模型小鼠耐受,于耐受小鼠体内提取的DC为DC3。通过FACS分析测定细胞表面抗原,ELISA法测定DC分泌IL-12 p70的量,MLR测定DC刺激功能。将上述DC过继至BALB/c小鼠体内。采用低剂量STZ(40 mg/kg)连续5次腹腔注射建立小鼠T1D模型。每周测定血糖,4周后处死所有动物,取胰腺进行HE染色作病理组织学检查,采用TUNEL原位末端标记法作胰岛β细胞凋亡检测。分离脾脏淋巴细胞并进行体外培养,测定小鼠脾淋巴细胞增殖反应和CD4+CD25+调节性T细胞亚群比例。ELISA法测定血清细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10的含量。结果:(1)采用STZ小剂量连续腹腔注射可在小鼠体内建立稳定的以胰腺β细胞炎性破坏为主要病理特征的T1D模型。与模型组相比,胰岛素sc组血糖值明显降低(P<0.05),而胰岛素po组则无明显差异。胰腺HE染色发现模型组胰腺有明显的炎性细胞浸润,而胰岛素sc组胰岛基本无浸润。免疫组织化学染色结果发现,胰岛素皮下注射可有效减少β细胞凋亡。与模型组相比,胰岛素sc组脾淋巴细胞增殖能力降低(P <0.05)。胰岛素皮下注射可有效抑制IL-2和IFN-γ分泌,而提高IL-4和IL-10的含量。(2)少量多次STZ诱导的T1D模型小鼠骨髓前体在GM-CSF和IL-4的诱导下难以分化为正常的DC,细胞表面CD11c呈低水平表达。胰岛素皮下注射诱导小鼠耐受后,小鼠骨髓来源树突状细胞CD11c表达正常,但共刺激分子和MHC-II分子表达下降,呈现不成熟DC(iDC)的状态;与正常小鼠来源的成熟状DC(mDC)相比,IL-12 p70分泌量下降,混合淋巴细胞反应中DC刺激能力减弱。模型对照组脾脏CD4~+CD25~+调节性T细胞含量较低,胰岛素自身抗原连续应用后,CD4~+CD25~+调节性T细胞数量明显上升。(3)多种方式处理的骨髓细胞表面均表达高水平的DC相对特异性标志CD11c。与DC0相比,其余3种DC均以表面共刺激分子和MHC-II分子表达减少,IL-12 p70分泌下降以及刺激功能减弱为特征,表现出不成熟状态。过继转移这些经处理的iDC可使小鼠血糖明显降低。组织病理检查发现胰岛内炎症细胞浸润减少,组织结构相对完整;过继耐受性DC的各组胰岛β细胞凋亡情况明显减轻。MTT法测定淋巴细胞增殖能力结果显示,受保护小鼠淋巴细胞增殖能力明显下降。FACS测定结果显示CD4~+CD25~+T细胞亚群比例显著升高。耐受性DC过继可有效抑制IL-2和IFN-γ,而提高IL-4和IL-10含量。结论:实验结果初步证明:(1)皮下注射自身抗原胰岛素可以诱导小鼠体内免疫耐受,促进免疫反应向Th2型偏离,抑制淋巴细胞增殖能力并保护胰岛β细胞免受损伤,最终防止T1D的发病。(2)自身抗原胰岛素对STZ所致T1D小鼠免疫保护作用与改善功能异常的DC,并诱导不成熟DC的出现,促进CD4~+CD25~+调节性T细胞分化而建立免疫耐受有关。(3)体外单独采用GM-CSF,或加用IL-4和PHC醇提物,T1D发病前期小鼠体内给予自身抗原胰岛素均可以诱导呈现不成熟状态的耐受性DC的产生。过继这些耐受性DC可有效诱导免疫耐受从而保护小鼠免得T1D,其机制与促进体内CD4~+CD25~+T细胞亚群产生,重建体内Th1/Th2细胞因子平衡相关。